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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.87.2021.tde-29042022-112018
Documento
Autor
Nome completo
Myrian Thiago Pruschinski Fernandes
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2021
Orientador
Banca examinadora
Dantas, Viviane Abreu Nunes Cerqueira (Presidente)
Andreotti, Andrezza Justino Gozzo
Ho, Paulo Lee
Oliveira, Gabriel Stephani de
Título em português
Sistema repórter controlado pelo promotor de involucrina como ferramenta para monitorar a diferenciação de células epidérmicas
Palavras-chave em português
células-tronco mesenquimais
diferenciação de queratinócitos
gene repórter
modelo de pele
promotor de involucrina
Resumo em português
A epiderme é um epitélio estratificado composto por várias camadas de queratinócitos, cuja função e homeostasia dependem da adequada proliferação e diferenciação dessas células. Diferentes abordagens são exploradas para o estudo da pele, como as células-tronco, também empregadas em aplicações terapêuticas nesse órgão. As células-tronco mesenquimais (CTM) do cordão umbilical têm se mostrado seguras, de fácil obtenção e multipotentes. No entanto, sua transdiferenciação em queratinócitos permanece um desafio, sendo essencial uma estratégia simplificada para monitorar, em tempo real e in situ, a diferenciação dessas células. Considerando que a involucrina é uma proteína marcadora da diferenciação terminal epidérmica, seu promotor (pINV) oferece expressão estrato-específica, sendo eficiente para acessar a diferenciação dos queratinócitos. O objetivo deste trabalho foi construir um vetor com um gene repórter sob controle do pINV para monitorar a transdiferenciação de CTM do cordão umbilical em queratinócitos in vitro. A sequência mínima do pINV foi amplificada por reação em cadeia da polimerase (PCR) e inserida no vetor lentiviral LeGO-G/NeoOpt, a montante do gene repórter EGFP (do inglês, enhanced green fluorescence protein) , originando LeGO-GpINV. As CTM e células HaCaT (controle positivo) foram transduzidas com os estoques lentivirais, produzidos em células HEK 293T. A expressão de EGFP nas células transduzidas foi analisada por citometria de fluxo e microscopia de fluorescência em diferentes períodos de diferenciação. As CTM foram transdiferenciadas em queratinócitos pelo cultivo em meio de diferenciação KSFM (do inglês, Keratinocyte Serum Free Medium) com cálcio 1,8 mM e suplemento com EGF 5 ng/ml. A diferenciação de CTM foi acompanhada por alterações morfológicas e expressão de proteínas marcadoras da diferenciação epidérmica. A atividade das calicreínas teciduais (hK) 5, 6 e 7 foi detectada, em diferentes períodos, utilizando-se substratos fluorogênicos. A expressão de involucrina e citoqueratinas (CQ) 10 e 14 foi avaliada por citometria de fluxo. Ainda, a expressão de involucrina e filagrina foi avaliada por RT-qPCR e involucrina por western blot. Nas CTM transduzidas com LeGO-GpINV, houve aumento na expressão de EGFP nos dias 7 e 14 de diferenciação. Nas HaCaT, cerca de 75% das células expressaram EGFP e, após seleção com antibiótico específico, a expressão foi verificada em 95% das células. Em termos da diferenciação das CTM, após 14 dias, mais de 85% da população expressou involucrina, CQ 10 e 14 e houve aumento na expressão de involucrina e filagrina no dia 7 de diferenciação. A expressão dessas proteínas foi confirmada em células HaCaT. Houve um aumento na atividade de hK5, 6 e 7 após o sétimo dia de cultivo em meio de diferenciação, em comparação às células cultivadas em DMEM (meio de proliferação). Tal atividade foi acompanhada por alterações morfológicas típicas de queratinócitos. A ferramenta permitiu acessar a diferenciação de células epidérmicas temporalmente, preservando-se as culturas durante todo o processo. Esse sistema repórter abre perspectivas para melhor monitoramento da diferenciação das CTM em queratinócitos, possibilitando seu uso tanto em modelos de pele in vitro quanto in vivo, o que poderá fundamentar sua aplicação na medicina regenerativa.
Título em inglês
Reporter system controlled by involucrin promoter as a tool to follow the epidermal cells differentiation.
Palavras-chave em inglês
involucrin promoter
keratinocytes differentiation
mesenchymal stem cells
reporter gene
skin model
Resumo em inglês
The epidermis is a stratified epithelium with several layers of keratinocytes whose function and homeostasis depend on the adequate proliferation and differentiation of these cells. Different approaches have been explored to study the skin biology, such as the stem cell, also been employed in therapeutic applications in this organ. Mesenchymal stem-cells (MSC) from umbilical cord have been shown safe, easily to obtain and multipotent. However, the MSC transdifferentiation into keratinocytes remains a challenge, being essential a simplified strategy to monitor, in real-time and in situ, the differentiation of these cells. Since the involucrin is a marker of keratinocyte terminal differentiation, its promoter (pINV) allows stratum-specific expression, consisting of an efficient way to access the differentiation of the keratinocytes. The aim of this work is to design a vector containing a reporter gene under control of pINV to access the umbilical cord MSC transdifferentiation into keratinocytes in vitro. The minimal sequence of pINV was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and inserted into the lentiviral vector LeGO-G/NeoOptp, upstream of the reporter gene EGFP (enhanced green fluorescence protein), originating LeGO-GpINV. The CTM and HaCaT cells (positive control) were transduced with the lentiviral stocks, produced in HEK 293T cells. The EGFP expression was assessed in the transduced cells by flow cytometer and fluorescent microscope in different time points after differentiation. The MSC were transdifferentiated into keratinocytes through cultivation in KSFM (Keratinocyte Serum Free Medium) in the presence of calcium 1.8 mM and supplement with EGF 5 ng/ml. The MSC differentiation was confirmed by morphological changes and by the expression of epidermal markers. The activity of tissue kallikreins (hK) 5, 6 and 7 was detected in different periods using fluorogenic substrates. The involucrin and keratin (K) 10 and 14 expression were assessed by flow cytometer. Moreover, the involucrin and filaggrin expression was confirmed by RT-qPCR and involucrin by western blot. In CTM transduced with LeGO-GpINV, there was a significant improvement in the expression of EGFP in MSC differentiated for 7 and 14 days. In HaCaT, almost 75% of the cells expressed EGFP and, after selection with specific antibodies, the expression was verified in 95% of the cells. In terms of CTM differentiation, after 14 days, more than 85% of the population expressed involucrin and K10 and K14 and there was an improvement in the involucrin and filaggrin expression on the 7th day of differentiation. The protein expression was confirmed in HaCaT. There was a significant improvement of hK5, 6 and 7 activity after the seventh day of culture in differentiation media, compared to the culture in DMEM (proliferation media). Such activity was accompanied by typical morphological alterations of keratinocytes. This tool allows to access temporally the epidermal cells differentiation, maintaining the culture during all the process. That reporter system opens perspectives for the better monitoring of the differentiation of MSC into keratinocytes, making possible its use in both in vitro and in vivo skin models, which could support its application in regenerative medicine.
 
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Data de Liberação
2024-04-28
Data de Publicação
2022-06-06
 
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