O aumento de bactérias resistentes aos antibióticos é um grave problema de saúde pública que requer a identificação de moléculas que atuem em alvos moleculares importantes e específicos dos patógenos favorecendo seu controle. Vários análogos de poliaminas foram construídos e usados no controle de microrganismos e células tumorais. Migalina é uma acilpoliamina, derivada da hemolinfa da aranha Acanthoscurria gomesiana, sendo um análogo da espermidina e a presença de grupos acil na sua estrutura pode favorecer sua função efetora, cujos mecanismos são desconhecidos. Neste trabalho foi avaliado o mecanismo molecular da interação da migalina sintética com E. coli DH5α e células fagocíticas, da linhagem celular J774A.1, RAW 264.7 e macrófagos primários derivados de medula óssea murina. Paralelamente foi realizada uma análise in silico usando acoplamento molecular e similaridade com outras moléculas. Nossos dados mostram que a migalina tem efeito bactericida dose e tempo dependentes em E. coli. Houve redução da viabilidade celular após 4 e 6 horas de tratamento com 1 mM deste composto. Além disso, o tratamento de E. coli com migalina (250 e 500 μM) induziu a produção de altos níveis de produtos derivados do oxigênio (ROS), fragmentação e dano oxidativo no DNA. Em outro análise foi comprovado que houve desestruturação da membrana bacteriana, de modo similar ao ocorrido com alguns antibióticos, havendo o mesmo nível de incorporação do iodeto de propídio. Estes dados foram reforçados pelo encontro de níveis elevados de fluorescência no ensaio de atividade de esterase, indicando alteração na membrana celular de E. coli após tratamento com a migalina. Ao avaliar o nível de glutationa redutase nas bactérias tratadas, houve redução de 20% em relação aos grupos não tratados. Estes resultados comprovam que o mecanismo de ação da migalina sobre E. coli envolve a geração de ROS, quebra do DNA e desestruturação da membrana bacteriana. A migalina não apresentou citotoxicidade, nem induziu a expressão de mediadores inflamatórios em estudos in vitro usando células fagocíticas. Em modelo usando células fagocíticas ativadas com LPS, foi definido que os alvos dessa molécula foi o receptores Toll-like 4, uma vez que a adição de migalina às células tratadas com LPS reduziu o nível de NO e TNF-α e a expressão dos genes para iNOS, TNF-α, IL-6 e COX-2, assim como a expressão da proteína p65 do fator NF-kB em doses superiores a 150 μM. Foi também comprovado que a migalina se liga ao LPS, sendo que a pré-incubação dessas moléculas antes da ativação dos macrófagos neutralizou a atividade do LPS, reduzindo a produção de NO de modo dose dependente. A triagem virtual e a modelagem molecular confirmaram que um dos mecanismos de ação da migalina ocorre via TLR4, através da interação com a molécula adaptadora MD2. Os dados mostraram que a migalina pode neutralizar a ação do LPS bloqueando a interação LPS/TLR4-MD2. Os resultados indicam que a migalina tem potencial antibacteriano, além de efeito supressor da resposta inflamatória induzida por LPS, sendo uma nova molécula atrativa a ser estudada para o controle de infecções.

The increase in antibiotic-resistant bacteria is a serious public health problem, requiring the identification of molecules that act on important and specific molecular targets of pathogens that control bacterial survival and help fight infections. Several polyamine analogues have been constructed and used to control microorganisms and tumour cells. Mygalin is a synthetic acylpolyamine, analogous to spermidine, derived from the hemolymph of the spider Acanthoscurria gomesiana and the presence of acyl groups in its structure can differentiate its effector function. However, the mechanisms involved are unknown. In this work, the molecular mechanism of the interaction of mygalin with E. coli and phagocytic cells, J774A.1 cell line, RAW and primary macrophages derived from murine bone marrow was evaluated. In parallel, an in silico analysis was performed using molecular docking and similarity with other molecules. Our data show that mygalin has a bactericidal effect that is dose and time-dependent on E. coli. There was a reduction in cell viability after 4 and 6 hours of treatment with 1 mM of the compound. In addition, the treatment of E. coli with mygalin (250 and 500 μM) induced the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), fragmentation and oxidative damage to DNA. Another analysis showed that the compound disrupted the bacterial membrane, similar to the action mechanism of some antibiotics, with the same level of incorporation of propidium iodide. The high fluorescence levels observed in the esterase activity assay reinforce these data, indicating a change in the E. coli cell membrane after treatment with mygalin. Additionally, the glutathione reductase levels were 20% decreased as compared to the untreated groups. These results prove that the mechanism of action of mygalin on E. coli involves the generation of ROS, DNA breakdown and damage to the bacterial membrane. In vitro studies using phagocytic cells have shown that mygalin does not present cytotoxicity, nor does it induce the expression of inflammatory mediators. In a model using LPS-activated phagocytic cells, the addition of mygalin in doses greater than 150 μM to LPS-treated cells reduced the levels of NO and TNF-α, the expression of genes for iNOS, TNF-α, IL-6, and COX2, as well as the expression of the NF-kB factor p65 protein. These results suggest that Toll-like 4 receptors are the target of mygalin. Our data also indicate that mygalin binds to LPS and that its pre-incubation with LPS before the activation of macrophages neutralized LPS activity, reducing NO production in a dose-dependent manner. The virtual screening and molecular docking confirmed that one of the mechanisms of action of Mygalin occurs via TLR4, through the interaction with the adapter molecule MD2. The data show that mygalin can act via the neutralization of LPS and blocking the LPS/TLR4-MD2 interaction. The results indicate that mygalin has antibacterial potential, in addition to suppressing the inflammatory response induced by LPS, being a new attractive molecule to be studied for infection control.