As R-Espondinas (RSPOs) compõem uma família de proteínas secretadas conhecidas por seus papéis importantes na proliferação, diferenciação e morte celular, induzindo a via de Wnt. Estudos têm demonstrado a importância das RSPOs na regulação de vários processos tecido-específicos, em particular a proliferação de células-tronco intestinais. RSPO1 destaca-se quanto ao seu potencial uso terapêutico na área de Medicina Regenerativa, dado seu potencial mitogênico em células-tronco, em particular, na manutenção do nicho de células-tronco da cripta do intestino delgado. Neste trabalho, foram geradas plataformas estáveis de expressão da RSPO1 humana recombinante (rhRSPO1) empregando os dois sistemas de expressão de células de mamífero mais utilizados para a produção de biofármacos, células HEK293 e CHO-DG44. Descrevemos em detalhes a produção estável em altos níveis da rhRSPO1, com alto grau de pureza e devidamente caracterizada em relação à sua estrutura peptídica e padrão de glicosilação, além de sua atividade biológica in vitro e in vivo. Visando sua aplicação na regeneração de intestino, investigamos a atividade da proteína rhRSPO1 sobre o cultivo de unidades organóides intestinais (UO) e na formação de intestino delgado engenheirado (TESI, do inglês Tissue-Engineered Small Intestine murino utilizando scaffolds biodegradáveis, bem como ensaios preliminares sobre a regeneração de fígado. Concluimos que o tratamento com rhRSPO1, e a consequente ativação da via canônica de Wnt, melhorou o cultivo de UO intestinais in vitro, aumentando seu tamanho e taxa de sobrevivência. Pelos ensaios de Engenharia de Tecidos in vivo, constatamos que o tratamento resultou em na melhora da formação do TESI, com aumento do grau de desenvolvimento dos tecidos, aumento de massa e da taxa de sucesso na pega do enxerto. Avaliamos ainda a atividade funcional da rhRSPO1 na adaptação intestinal em modelo de zebrafish induzido à Síndrome do Intestino Curto (SIC) pela ressecção cirúrgica da porção medial do intestino. Neste experimento de resgate, no qual a rhRSPO1 foi administrada por via intraperitoneal nos animais por uma ou duas semanas, observamos que o tratamento aumentou a proliferação precoce de células-tronco intestinais (ISCs), o acúmulo de β-catenina e reduziu a perda de peso dos peixes após ressecção maciça do intestino, mas não interferiu nos parâmetros intestinais de adaptação e na formação de esteatose hepática neste modelo. Assim, constatamos que a rhRSPO1 é essencial para a manutenção do nicho de ISC e a homeostase do epitélio intestinal, melhorando a regeneração epitelial após lesão. Portanto, podemos concluir que a plataforma de expressão desenvolvida nesse projeto foi bem-sucedida quanto à geração de rhRSPO1 com qualidade e em quantidade suficiente para ser utilizada em estudos funcionais, em escala laboratorial, na área de Engenharia de Tecidos e Medicina Regenerativa aplicada ao tratamento da SIC em modelos animais. Concluímos ainda que o tratamento com rhRSPO1 é bastante promissor no que diz respeito à geração de um intestino engenheirado funcional e melhora dos sintomas da SIC. Entretanto, novas otimizações do processo produtivo, bem como um maior número de estudos biológicos fazem-se necessários para que tratamentos com rhRSPO1 venham a ser viáveis e seguros, futuramente, para estas e outras aplicações terapêuticas.

R-Spondin (RSPO) comprise a family of secreted proteins known for their important roles in cell proliferation, differentiation and death, by inducing the Wnt pathway. Several studies have demonstrated the importance of RSPOs in the regulation of several tissue-specific processes, including the proliferation of intestinal stem cells. The RSPO1 stands out with respect to its potential therapeutic use in the Regenerative Medicine field, due to its mitogenic activity in stem cells, particularly in the small intestine crypt stem cell niche maintenance. In this work, stable expression platforms of recombinant human RSPO1 (rhRSPO1) were generated using the two most used mammalian cell expression systems for the production of biopharmaceuticals, HEK293 and CHODG44 cells. We describe in detail the stable production of rhRSPO1 at high levels, with a high degree of purity and properly characterized in relation to its peptide structure and glycosylation pattern, in addition to biological activity in vitro and in vivo. Aiming its application in intestinal regeneration, we investigated the rhRSPO1 protein activity on the cultivation of intestinal organoid units (OU) and in the formation of murine Tissue-Engineered Small Intestine (TESI) using biodegradable scaffolds, as well as in preliminary tests on liver regeneration. Based on the results, we were able to conclude that the rhRSPO1 treatment, and the consequent activation of the canonical Wnt pathway, improved the cultivation of intestinal OU in vitro, increasing its size and survival rate. Through the in vivo Tissue Engineering assays, we verified that the treatment resulted in an improvement in TESI formation, increasing its mass, degree of tissue development and engraftment success rate. We also evaluated the functional activity of rhRSPO1 in intestinal adaptation in a zebrafish short bowel syndrome (SBS) model induced by surgical resection of the medial portion of the intestine. In this rescue experiment, in which rhRSPO1 was administered intraperitoneally to the animals for one or two weeks, we observed that the treatment increased an early intestinal stem cell (ISC) proliferation, β-catenin accumulation and fish weight loss improvement after massive intestinal resection, but did not interfere in intestinal adaptation parameters and hepatic steatosis formation in this model. Accordingly, we found that rhRSPO1 is essential for the maintenance of the ISC niche and intestinal epithelium homeostasis, improving epithelial regeneration after injury. Therefore, we can conclude that the expression platform developed in this project was successful in generating rhRSPO1 with sufficient quality and quantity to be used in laboratory scale functional studies in the Tissue Engineering and Regenerative Medicine area applied to the SBS treatment in animal models. We also concluded that the rhRSPO1 treatment is very promising with regard to the generation of a functional tissue engineered intestine and SBS symptoms improvement. However, new optimizations of the production process, as well as a greater number of biological studies are necessary for rhRSPO1 treatments to be viable and safe, in the future, for these and other therapeutic applications.