Existem mais de 7000 substâncias químicas no cigarro, sendo que, destas cerca de 70 substâncias são consideradas carcinógenos. Uma delas é o 4- (metilnitrosamino) -1 - (- 3-piridil) -1-butanona) ou NNK. Já é bem estabelecido que o NNK pode causar danos às células pulmonares, bem como às células da mama in vitro, e pode levar à formação de danos no DNA. O fígado é um dos órgãos responsáveis pelo seu metabolismo e entender qual o papel desse carcinógeno nos hepatócitos é muito importante, porém pouco se sabe sobre como esse carcinógeno atua na célula in vitro. Para isso, adotamos uma abordagem de exposição repetida para avaliar quais alterações e efeitos celulares ocorrem na linhagem AML12 de hepatócitos murinos imortalizados. As células AML12 foram expostas ao NNK por 30 ciclos, em diferentes concentrações, e o comportamento celular foi avaliado após a exposição a longo prazo. Na análise de citometria celular, o grupo exposto a 0,1 nM apresentou maior índice proliferativo, maior capacidade de invasão no ensaio de invasão transwell e maior sobrevivência quando cultivado em superfície de baixa adesão. No entanto, os testes de tumorigenicidade in vivo não mostraram crescimento tumoral, após a inoculação das células em camundongos imunodeficientes. No ensaio de exposição de curto prazo com MTT, as células apresentaram um aumento na viabilidade célular em 0,1 nM e 10 nM de NNK. No ensaio de wound healing, as células expostas a 10nM NNK por longo prazo apresentaram um fechamento mais rápido da lesão. O tempo de duplicação não mostrou diferença significativa. Nos ensaios de imunofluorescência, as células submetidas à exposição de longo prazo ao NNK apresentaram marcação para K-RAS, p53, C-Myc e ß-catenina. Nas análises de genotoxicidade, o teste do cometa que nos mostrou que as células AML12 tratadas com 10nM de NNK apresentaram maior escore em relação ao grupo controle, indicando uma maior quantidade de quebras de fita de DNA. O ensaio do micronúcleo mostra que não houve diferença estatística nas células expostas ao NNK em comparação com o grupo controle. Concluímos dizendo que, mesmo em baixas concentrações, NNK pode comprometer a dinâmica celular após exposição de longo prazo, mas alguns aspectos permanecem obscuros e requerem maiores estudos para sua elucidação.

There are more than 7000 substances in the tobacco cigarette smoke, 70 of which are considered carcinogenic and genotoxic. One of these byproducts is 4- (methylnitrosamino)-1-(-3-pyridyl)-1-butanone) or NNK. It is well established that NNK can cause damage to lung cells, as well as to breast cells in vitro, and can also lead to the formation of DNA damage. Liver is one of the organs responsible for its metabolism. Understanding which role of this carcinogen in hepatocytes is particularly important, however little is known about how this carcinogen acts this cell in vitro. So, we adopted a repeated exposure approach to assess which cellular changes and effects occur in the AML12 lineage of immortalized murine hepatocytes. AML12 cells were exposed to NNK for 30 cycles at different concentrations, and cell behavior was evaluated after long-term exposure. In cell cytometry analysis, the group exposed to 0.1nM showed a higher proliferative index, greater invasion capacity in transwell invasion assay and ability to survive when cultivated on low-attachment surface. However in vivo tumorigenicity tests showed no tumor growth in imunodeficient mice inoculated with these cells. Short term exposure of cells showed an increase in cell viability at 0.1nM and 10nM NNK in MTT assay. In the wound healing assay, cells exposed to 10nM NNK for long term showed faster-wound closure. The doubling time showed no significant difference. In immunofluorescence assays, cells subjected to long-term exposure to NNK showed labeling for K-RAS, p53, C-Myc and ßcatenin. In genotoxicity analyzes, the comet test showed that AML12 cells treated with 10nM NNK had a higher score compared to the control group, indicating a greater amount of DNA strand breaks. The micronucleus assay shows no statistical difference in cells exposed to NNK compared to the control group. Finally, we were able to demonstrate that even at low concentrations, NNK can compromise cell dynamics after long term exposure but some aspects remain unclear and require further studies to elucidate it.