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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.87.2021.tde-25112022-103052
Document
Auteur
Nom complet
Felipe Grabarz
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2021
Directeur
Jury
Gonçalves, Viviane Maimoni (Président)
Augusto, Elisabeth de Fatima Pires
Azzoni, Adriano Rodrigues
Pessoa Junior, Adalberto
Piccoli, Rosane Aparecida Moniz
Zangirolami, Teresa Cristina
Titre en portugais
Produção de interferon-alfa consenso recombinante em Escherichia coli:avaliação de estratégias para obtenção da proteína solúvel.
Mots-clés en portugais
Antiviral
Arbovírus
Biofármaco
E. coli
Interferon
Resumé en portugais
A indústria de biofármacos cresceu de forma acelerada nos últimos anos e seus produtos são utilizados como tratamento de diversas doenças. A citocina interferon- tem sido amplamente utilizada devido às suas propriedades antivirais e antineoplásicas, principalmente na manifestação do vírus da Hepatite C. Desenvolveu-se uma molécula recombinante não natural, o recombinant interferon consenso (cIFN), projetada após a análise da sequência de aminoácidos dos diversos subtipos de IFN-, gerando uma molécula consenso. Este trabalho visa desenvolver Bioprocessos para produção e purificação do cIFN em E. coli utilizando diversas estratégias para obtenção da proteína em forma solúvel e ativa. Inicialmente, a fusão proteica de cIFN com Fh8 e DsbC foi testada. Três proteínas de fusão com cIFN foram construídas em laboratório: HF-IFN (tag Fh8 fusionada ao cIFN); HD-IFN (tag DsbC fusionado ao cIFN) e o H-IFN (cIFN fusionada apenas com His-tag e sem tag de solubilidade). Os resultados obtidos, indicam que a presença da tag Fh8 (HF-IFN) aumenta a produção da proteína alvo na fração solúvel e favorece a manutenção desta condição quando comparada a construção sem a tag (H-IFN). Ademais, a recuperação de cIFN derivada da construção HD-IFN foi inferior ao HF-IFN e, também, foi detectada a presença de diversos contaminantes que impediram o uso posterior da molécula. Assim, os experimentos com HF-IFN foram priorizados. Os parâmetros usados nos cultivos celulares também exerceram efeito sobre a solubilidade proteica. BL21(DE3) transformadas com o plasmídeo pET28a-HF-IFN foram cultivadas a 37 °C e induzidas com 1 mM de IPTG, o HF-IFN se concentrou majoritariamente na fração insolúvel. A diminuição da temperatura de 37 °C para 30 °C e a redução da concentração de IPTG de 1 mM para 0,1 mM usada na indução favoreceu o acúmulo na fração solúvel. Os resultados também sugerem que quanto maior o tempo de cultivo, maior é a tendência de a proteína tornar-se insolúvel. A produção também foi testada em outros três meios de cultura que não possuem proteína de origem animal: meio de cultura de autoindução e outros dois meios de cultura quimicamente definidos SDAB e HDF. O cultivo feito com a cepa BL21(DE3) transformada com o plasmídeo pET28a-HF-IFN em meio de autoindução a 30 °C teve maior rendimento de proteína alvo na fração solúvel quando comparado aos outros dois. Após a purificação da fusão HF-IFN por Q-Sepharose e IMAC-Ni2+, a retirada da tag Fh8 foi realizada por hidrólise enzimática mediada por TEV, graças ao sítio de clivagem inserido entre a tag Fh8 e o cIFN. A separação de cIFN foi realizada em nova IMAC-Ni+2. Os resultados obtidos demonstram que o cIFN recombinante foi obtido com 100% de pureza. Além disso, o cIFN exerceu forte atividade antiviral utilizando baixas concentrações da molécula produzida. Assim, a molécula foi capaz de inibir o efeito citopático de Arbovirus e também SARS-CoV-2 após a infecção em células VERO in vitro. Análise por dicroísmo circular de cIFN mostra que a estrutura secundária foi gerada como esperado. Assim, esta pesquisa visa contribuir com a geração de conhecimento aplicado na área da biotecnologia farmacêutica.
Titre en anglais
Production of recombinant interferon-alpha in Escherichia coli: evaluation of strategies for obtaining soluble protein.
Mots-clés en anglais
Antiviral
Arbovirus
Biopharmaceutical
E. coli
Interferon
Resumé en anglais
The biopharmaceutical industry has grown rapidly and its products are used to treat various diseases. The cytokine interferon- has been widely used due to its antiviral and antineoplastic properties, mainly in the manifestation of the Hepatitis C virus. An unnatural recombinant molecule, the recombinant interferon consensus (cIFN), developed after analyzing the sequence of amino acids of the various IFN- subtypes, generated a consensus molecule. This work aims to develop a bioprocess for the production and purification of cIFN in E. coli using different strategies to obtain the protein in soluble and active form. Initially, protein fusion of cIFN with Fh8 and DsbC was tested. Three cIFN fusion proteins were constructed in the laboratory: HF-IFN (tag Fh8 fused to cIFN); HD-IFN (DsbC tag fused to cIFN) and H-IFN (cIFN fused only with His-tag and without solubility tag). The results obtained indicate that the presence of the Fh8 tag (HF-IFN) increases the production of the target protein in the soluble fraction and favors the maintenance of this condition when compared to the construction without the tag (H-IFN). In addition, the recovery of cIFN derived from the HD-IFN construct was lower than that of HF-IFN, and the presence of several contaminants prevented the later use of the molecule. Thus, experiments with HF-IFN were prioritized. The parameters used in cell cultures also had an effect on protein solubility. When BL21 (DE3) transformed with the plasmid pET28a-HF-IFN were cultured at 37 °C and induced with 1 mM IPTG, the HF-IFN was mainly concentrated in the insoluble fraction. The decrease in temperature from 37 °C to 30 °C and the reduction of the IPTG concentration from 1 mM to 0.1 mM used in induction favored the accumulation in the soluble fraction. The results also suggest that the longer the cultivation time, the greater the tendency for the protein to become insoluble. The production was also tested in three other culture media that do not have animal protein: autoinduction culture medium and two other chemically defined culture media SDAB and HDF. The culture made with the BL21(DE3) strain transformed with the plasmid pET28a-HF-IFN in autoinduction medium at 30 °C had a higher yield of target protein in the soluble fraction when compared to the other two. After the purification of the HF-IFN fusion by Q-Sepharose and IMAC-Ni2 +, the removal of the Fh8 tag was performed by TEV-mediated enzymatic hydrolysis, using a cleavage site inserted between the Fh8 tag and the cIFN. The cIFN separation was performed in a IMAC-Ni+2. The results obtained demonstrate that the recombinant cIFN was obtained with 100% purity. In addition, cIFN exerted strong antiviral activity using low concentrations of the produced molecule. Thus, the molecule was able to inhibit the cytopathic effect of Arbovirus and also SARS-CoV-2 after infection in VERO cells in vitro. Analysis by circular dichroism of cIFN shows that the secondary structure was generated as expected. Thus, this research aims to contribute to the generation of applied knowledge in the field of pharmaceutical biotechnology.
 
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Date de Publication
2022-12-07
 
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