A biópsia tecidual é a técnica mais utilizada para o diagnóstico e caracterização molecular do câncer. Entretanto, além de ser um procedimento invasivo, a biópsia tecidual é limitada à região do tecido selecionada, pouco representando a heterogeneidade do tumor. A necessidade de abordagens mais precisas e o avanço de tecnologias, impulsionam estudos que avaliam componentes circulando em biofluidos, a chamada “biópsia líquida”. Neste estudo foram avaliadas duas técnicas para detecção da presença tumoral a partir do plasma: a concentração e a variação no tamanho de vesículas extracelulares circulantes e o perfil de microRNAs circulantes. MicroRNAs são bons candidatos devido à sua estabilidade em plasma, em associação com proteínas específicas ou no interior de vesículas extracelulares. O câncer de cabeça e pescoço é o sétimo tipo de câncer mais comum no mundo. Foram selecionados portadores de carcinoma epidermoide de cabeça e pescoço nos subsítios laringe e orofaringe. A técnica pulso resistivo ajustável (TRPS) e citometria de fluxo foram utilizadas para a caracterização das vesículas extracelulares e microRNAs circulantes foram detectados utilizando a tecnologia nCounter, plataforma Nanostring. Adicionalmente, microRNAs e mRNAs presentes em tecido tumoral foram analisados para inferir a origem dos microRNAs circulantes e sua relação com a progressão tumoral. Observamos alterações na concentração de vesículas celulares na presença do tumor. A TRPS constitui uma técnica com bom potencial para aplicação em laboratórios clínicos por não necessitar de processamento complexo de amostras, entretanto os resultados demonstram que ajustes finos, dificilmente padronizáveis com o atual estado de desenvolvimento da tecnologia, são necessários para esta aplicação no futuro. O perfil de microRNAs no plasma mostrou diferenças significativas entre as amostras coletadas antes e após tratamento. A análise de expressão diferencial indicou 10 microRNAs diferencialmente expressos, sete já descritos em plasma ou soro de pacientes de CEPC e diferencialmente expressos quando comparados pacientes e indivíduos saudáveis. Em tecido, 79 microRNAs estavam diferencialmente expressos, sendo 48 com maior expressão e 31 com menor expressão em tecido tumoral. MicroRNAs com expressão elevada em tecido tumoral não refletiram nas moléculas mais expressão em plasma, assim como também encontramos microRNAs com menor expressão em tumor e maior expressão em plasma de paciente antes do tratamento. Como exemplo, o miR-150-5p visto mais expresso em plasma de pacientes antes do tratamento enquanto teve menor expressão no tecido tumoral. Ao analisar os dados de mRNA do tecido, genes preditos como alvos deste microRNA estavam mais expressos. Na literatura, o miR-150-5p já foi descrito como um supressor tumoral em CECP, porém encontrado em vesículas extracelulares derivadas de linhagens celulares, sugerindo um possível mecanismo de encapsulamento seletivo deste miRNA que explicaria a detecção elevada em plasma e não em tecido. A complexidade das interações que envolvem microRNAs e processos de liberação destas moléculas no plasma sugerem que a utilização de um perfil de expressão validado em diferentes coortes e não o uso de moléculas únicas é mais promissor para uma futura utilização como biomarcador para o diagnóstico e acompanhamento de resposta terapêutica em câncer.

Currently, tissue biopsy is still the most used technique for diagnostic confirmation and tumor characterization. However, it is an invasive procedure, and due to tumor heterogeneity, it may represent only a limited part of the tumor, missing out important molecular characteristics. For this reason, liquid biopsy is a promising alternative for diagnostic and early detection of tumors. In this study we evaluated two techniques for the detection of tumor using plasma: the concentration and sizes of extracellular vesicles and circulating microRNAs. MicroRNAs are good candidates for molecular markers due to their stability in plasma in association with proteins or encapsulated in extracellular vesicles. Head and neck squamous cell carcinoma is the seventh most common cancer type worldwide. Patients harboring cancer at the larynx and oropharynx subsites were selected for this study. The tunable resistive pulse sensing technique was used for the characterization of extracellular vesicles and circulating microRNAs were detected using the nCounter technology (NanoString). This technology, based on the digital counting of molecules, detects molecules even in low concentrations using specific probes. Additional analysis included the characterization of extracellular vesicles using flow cytometry, and the evaluation of microRNAs and mRNAs in tumor tissue in order to infer the origin of circulating miRNAs and their association with tumor progression in the tissue. Alterations in the concentration of extracellular vesicles were detected in the presence of tumors. The TRPS technology is an interesting solution for clinical laboratories since there is no need for complicated sample processing but results depend on fine settings hard to implement with the current state of development. Circulating miRNA profiles showed marked differences between plasma samples from HNSCC patients and those obtained when patients were tumor-free. Differential expression analysis indicated 10 miRNA differentially expressed. Seven of these have been previously detected in plasma or serum of HNSCC patients and differently expressed between HNSCC patients and healthy individuals. In tissue, 79 miRNAs were differentially expressed, with 48 upregulated in tumor tissue and 31 downregulated. miRNAs detected in high levels in tissue did not reflect molecules most detected in plasma, as well, miRNAs with lower expression in tumor tissue were found upregulated in plasma from patients with tumor. MiR- 150-5p was downregulated in tumor tissue but upregulated in plasma from patients with tumor. When analyzing tissue data, mRNA from predicted miR-150-5p gene targets were upregulated. In the literature, miR-150-5p has been described as an anti-tumor miRNA in HNSCC, but enriched in extracellular vesicles from HNSCC-derived cell lines, suggesting a selective sorting mechanism of miRNAs into vesicles that could explain its difference in expression pattern in plasma from HNSCC patients and tumor tissue. Circulating miRNA profiling may be a powerful tool to monitor tumor presence, although individual molecules or a small set of miRNAs are unlikely to be directly used as biomarkers due to the variety of processes modulated during tumor progression and that are readily reflected in plasma.