A leptospirose é uma zoonose mundialmente disseminada causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira spp, cuja diversidade antigênica está associada ao lipopolissacarídeo de sua superfície. Adesinas de superfície de leptospiras patogênicas como as proteínas Lsa63 e Lsa45 são capazes de induzir resposta humoral em camundongos e ligarem-se a componentes de matriz extracelular facilitando a infecção pela bactéria. Atualmente, vacinas para leptospirose são compostas de bacterinas e se baseiam na proteção via indução de anticorpos contra lipopolissacarídeo. Elas não são capazes de gerar memória imunológica e são específicas contra sorovares presentes na formulação. No Brasil, não existe nenhuma vacina licenciada para uso humano contra a doença. Estudos demonstram aumento da imunogenicidade contra LPS de Leptospira patogênicas quando conjugado aos toxóides diftérico e tetânico, e também indicam a presença de antígenos comuns ou extremamente conservados entre esses LPS e a molécula proveniente de L. biflexa, saprófita. Dessa forma, esse trabalho tem por objetivo a produção, purificação e modificação das adesinas de superfície Lsa45 e Lsa63 identificadas em L. interrogans. A Lsa63 foi empregada na conjugação com o lipopolissacarídeo de L. biflexa. As melhores condições para síntese proteica foram em Escherichia coli utilizando sistema de expressão pET28a em frascos Tunair ™ e meio ZYM-5052 a 20°C para Lsa45 e em pET101 em frascos Erlenmeyer e meio 2YTON a 30°C para Lsa63. Ambas as proteínas foram purificadas através de cromatografia de afinidade ao metal seguido de troca catiônica, com pureza final e rendimento de 92% e 29% para Lsa45 e 94% e 14% para Lsa63. Uma etapa anterior à conjugação foi a modificação das proteínas com diidrazida do ácido adípico utilizando cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio como ativador, resultando em um aumento de 3 vezes no conteúdo de grupos amina para a proteína Lsa45 e de 1,4 a 2 vezes para Lsa63. Apesar das dificuldades encontradas na obtenção de massa de células, o lipopolissacarídeo de L. biflexa foi extraído através do método fenol-água a quente com rendimento de 0,9% após purificação. O lipopolissacarídeo de L. biflexa foi ativado com o tetrafluorborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridínio seguido pela conjugação com a proteína Lsa63 modificada, gerando um produto com massa molecular acima de 140 kDa. Em conjunto, nossos dados mostram o potencial de obtenção de conjugado para posterior uso em estudos imunológicos como possível candidato vacinal contra leptospirose.

Leptospirosis is a zoonosis spread worldwide by pathogenic bacteria of the genus Leptospira spp, whose antigenic diversity is associated with the lipopolysaccharide (LPS) on its surface. Surface adhesins of pathogenic leptospires such as Lsa63 and Lsa45 are able to induce humoral response in mice and bind to extracellular matrix components, facilitating the infection by the bacteria. Currently, leptospirosis vaccines are composed of bacterins and are based on blockage-inducing protection against LPS. However, they are not capable of generating immune memory and are specific against serovars present in its formulation. In Brazil, there is no vaccine licensed for human use against this disease. Studies showed increased immunogenicity against pathogenic Leptospira LPS when conjugated to diphtheria and tetanus toxoids, and also indicate the presence of common or extremely conserved antigens among these LPS and the same saprophyte L. biflexa molecule. Thus, this work aims to produce, purify and modify the surface adhesins Lsa45 and Lsa63 identified in L. interrogans. Lsa63 was used in the conjugation with L. biflexas LPS. Best conditions for protein synthesis were achieved in Escherichia coli using pET28a expression system in Tunair ™ flasks and ZYM-5052 medium at 20 ° C for Lsa45 and in pET101 in Erlenmeyer flasks and 2YTON medium at 30 ° C for Lsa63. Both proteins were purified by metal affinity chromatography followed by cation exchange, with final purity and yield of 92% and 29% for Lsa45 and 94% and 14% for Lsa63. A step prior to conjugation was the modification of the proteins with adipic acid dihydrazide, using 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholine as an activator, resulting in an increase of 3 times in the content of amine groups for Lsa45 and 1.4 to 2 times for Lsa63. Despite the difficulties detected in cell mass obtaintion, LPS of L. biflexa was extracted using phenol-hot water method with 0.9% yield after purification. The LPS was activated with 1-cyano-4- dimethylaminopyridinium tetrafluorborate followed by conjugation with modified Lsa63, generating a product with molecular mass above 140 kDa. Together, our data show the conjugate obtaintion potential for further use in immunological studies as a possible vaccine candidate against leptospirosis.