O plasma de uma série de animais possui componentes que promovem uma resistência natural ao envenenamento, através da inibição de proteínas específicas que compõem o veneno das serpentes, como as fosfolipases A2 (PLA2s). A hipótese mais consistente para a presença de tais inibidores seria a proteção contra o auto envenenamento. Porém, a ocorrência de inibidores no plasma de serpentes não peçonhentas, bem como em outras espécies de animais, abriu novas perspectivas em relação à presença de tais moléculas. Deste modo, o presente trabalho tem como objetivo a identificação, o isolamento e a caracterização de um inibidor de PLA2 (PLI) presente no soro da Boa constrictor (BoaPLI), serpente não peçonhenta que habita extensamente o território brasileiro. Para tal, o inibidor foi isolado do soro de B. constrictor através de dois passos cromatográficos, tendo 0,63% de recuperação. A partir de então, foi realizada sua caracterização estrutural por SDS-PAGE, sendo identificada uma banda principal a 25 kDa, em condições redutoras, e 20 kDa, em condições não redutoras. Sua estrutura primária parcial foi identificada, possuindo alta homologia com outros PLIγs, como o de Lachesis muta. Sua estrutura secundária também é semelhante a outros PLIγs. Além disso, quando incubado com a Asp-49 e Lys-49 PLA2s, em análise por dicroísmo circular, observou-se que não houve alteração severa de seu espectro. As análises cromatográficas de exclusão molecular (SEC) corroboraram a hipótese de formação de oligômeros do inibidor isolado. Para investigar o tipo de interação entre o PLI e PLA2s, uma varredura de fluorescência foi realizada, mostrando uma diminuição no pico da fluorescência quando incubadas. A interação entre inibidor e PLA2 também foi evidenciada por western blotting. Uma vez a interação confirmada, foi realizado o ensaio de inibição enzimática com a Asp-49 PLA2, uma vez que a substituição no resíduo 49 (Lys-49 PLA2) leva a perda de atividade enzimática. O BoaγPLI apresentou inibição de caráter dose-dependente, chegando a ∼48% de inibição. Seu potencial inibitório também foi certificado por ensaios farmacológicos de edema e miotoxicidade. Não houve diferença entre o potencial inibitório com as duas isoformas de PLA2s testadas. Para averiguar o envolvimento do inibidor com tal atividade, foi realizado o ensaio de tromboelastometria, no qual o tempo de coagulação foi diminuído quando a crotoxina foi incubada com o inibidor. Ademais, para investigação do potencial inibitório do BoaγPLI em relação ao veneno total de uma serpente ofiófaga, foi testada a sua ação inibitória da atividade anticoagulante do veneno de Micrurus laticollaris. O BoaγPLI foi eficaz na inibição da atividade anticoagulante, evidenciado pelo retorno em tempo de coagulação e da força do coágulo comparado ao controle. Deste modo, o presente estudo pode contribuir introduzindo novas perspectivas para inibidores de PLA2 provenientes de plasma de serpentes não peçonhentas.

Plasma in several organisms has components that promote a natural resistance to envenomation by inhibiting specific proteins that constitute snake venoms, such as phospholipases A2 (PLA2s). The most consistent hypothesis for the presence of such inhibitors would be protection against self-envenomation in venomous snakes, but the occurrence of inhibitors in the plasma of non-venomous snakes, as well as in other species of animals, has opened new perspectives for the presence of these molecules. Thus, the work aimed to identify, isolate, and characterize a PLA2 inhibitor (PLI) present in the serum of Boa constrictor, a non-venomous snake that dwells extensively in the Brazilian territory. For such purpose, the inhibitor was isolated from B. constrictor serum by two chromatographic steps, with 0.63% of recovery. From this point on, the structural characterization was performed by SDS-PAGE, which showed a major band at 25 kDa under reducing conditions and 20 kDa under non-reducing conditions. Its partial primary structure was identified, possessing high homology with other PLIγs, such as Lachesis muta. Its secondary structure is also similar to other PLIγs. In addition, when incubated with Asp-49 and Lys-49 PLA2s, analyzed by circular dichroism, showed that there was no severe change in its spectrum. The chromatographic analysis of molecular exclusion corroborated the presence of oligomers in the isolated inhibitor. To investigate the interaction between the PLI and the PLA2, a fluorescence scan was performed, showing a decrease in the fluorescence peak when incubated. The interaction between inhibitor and PLA2 was also confirmed by western blotting. Once the interaction was established, an enzymatic inhibition assay was performed only with Asp-49 PLA2, since the substitution on the 49 residue (Lys-49) leads to loss of enzymatic activity. The BoaPLI showed a dose-dependent inhibition, reaching at ~48% when the inhibitor was incubated with PLA2. Its inhibitory potential was also confirmed by pharmacological tests of edema and myotoxicity. There was no difference between the inhibitory potential with the two isoforms of PLA2s tested. To investigate the involvement of the inhibitor with such activity, a thromboelastometric assay was performed in which the coagulation time was decreased when the crotoxin was incubated with the inhibitor. Furthermore, to investigate the inhibitory potential of BoaγPLI in relation to the whole venom of an ophiophage snake, the inhibitory action of the anticoagulant activity of the venom of Micrurus laticollaris, ophiophage snake and sympatric to B. constrictor was also investigated, whereas the BoaγPLI was efficient on returning the clotting time and strength. Thus, the present work may provide new insights into protein inhibitors acting on envenomation in non-venomous snakes.