O ácido 5-aminolevulínico (ALA) é o primeiro precursor da via de biossíntese do heme, que pode sofrer oxidação em pH básico gerando espécies reativas de oxigênio (ROS) como o ânion radical superóxido (O₂^•-), peróxido de hidrogênio e radical hidroxila (•OH). Devido às mutações no gene da porfobilinogênio deaminase, o ALA pode acumular em desordens denominadas porfirias, particularmente as porfirias hepáticas agudas (PHA). Os distúrbios desencadeados por PHA acometem o sistema nervoso central, periférico e visceral e tem sido reportado uma maior incidência de câncer de fígado primário, em especial o carcinoma hepatocelular. Desta forma, o objetivo deste trabalho é investigar os mecanismos moleculares modulados pelo ALA através da análise do efeito sobre a expressão gênica de HepG2. O efeito de ALA sobre a viabilidade de HepG2 foi avaliada por testes como MTT e LDH. Medidas foram realizadas em células tratadas com diferentes concentrações (0 mM - 50 mM). Para o estudo de expressão gênica, HepG2 foram tratadas com 2,5 mM e 25 mM de ALA por um período de 2 h e 24 h. A análise do perfil de expressão gênica foi conduzida em lâminas de microarray. O perfil de expressão gênica obteve maior similaridade entre os tratamentos de 2 h e 24 h com 2,5 mM e entre os tratamentos de 2 h e 24 h com 25 mM. Um total de 1437 genes diferencialmente expressos (DEGs) foi identificado, dos quais 969 foram regulados positivamente e 468, regulados negativamente (2 h 2.5 mM= 891; 2 h 25 mM= 10; 24 h 2.5 mM= 470; 24 h 25 mM= 66). GDF15 e AKR1B10 foram DEGs presentes em todos os tratamentos. A análise de enriquecimento de vias foi realizada pelos bancos de dados KEGG, Reactome e Gene Ontology, seguida pela construção de redes de conectividade para o tratamento de 2 h com 2,5 mM e 24 h com 25 mM pelo MetaCore. No tratamento de 2h com 2,5 mM, processos biológicos associados à fosforilação oxidativa mitocondrial, homeostase de íons metálicos e resposta à proteína mal enoveladas foram enriquecidos. No tratamento de 2 h com 25 mM, processos associados à regulação do ciclo celular. Já para o tratamento de 24 h com 2,5 mM, os processos biológicos modulados por ALA foram relacionados à fosforilação oxidativa mitocondrial e diferenciação celular. No tratamento de 24 h com 25 mM foram enriquecidas múltiplas vias associadas aos processos metabólicos de detoxificação de cetonas e aldeídos, sinalização induzida por estresse oxidativo, regulação de morte celular, senescência, e vias relacionadas à resposta imunológica. A análise de redes de conectividade corrobora com os resultados do enriquecimento e indicou que vias como Wnt/-catenina poderia estar envolvida na ação de ALA. A identificação da complexa rede de vias de sinalização moduladas por ALA em diferentes concentrações e períodos de tratamento indica quais processos celulares podem estar envolvidos nos mecanismos de ação diretos e indiretos do ALA e contribui para melhor compreender seu papel nos sintomas de doenças como as porfirias agudas.

5-Aminolevulinic acid (ALA) is the first precursor of the heme biosynthesis pathway, which may undergo oxidation at basic pH generating reactive oxygen species (ROS) such as superoxide radical anion (O^2•-), hydrogen peroxide and hydroxyl radical (•OH). Due to mutations in the porphobilinogen deaminase gene, ALA can accumulate in disorders called porphyrias, particularly acute hepatic porphyrias (PHA). PHA-triggered disorders affect the central peripheral and visceral nervous systems and a higher incidence of primary liver cancer has been reported, especially hepatocellular carcinoma. Thus, the aim of this study is to investigate the molecular mechanisms modulated by ALA by analyzing the effect on HepG2 gene expression. The effect of ALA on HepG2 viability was evaluated by MTT and LDH assays. Measurements were performed on cells treated with different concentrations of ALA (0 mM - 50 mM). For the gene expression study, HepG2 were treated with 2.5 mM and 25 mM ALA for a period of 2 h and 24 h. Gene expression profile analysis was performed on microarray slides. The gene expression profile was more similar between the 2 h and 24 h treatments with 2.5 mM and between the 2 h and 24 h treatments with 25 mM. A total of 1437 differentially expressed genes (DEGs) were identified, of which 969 were up-regulated and 468 down-regulated (2 h 2.5 mM = 891; 2 h 25 mM = 10; 24 h 2.5 mM = 470; 24 h 25 mM = 66). GDF15 and AKR1B10 were DEGs present in all treatments. Pathway enrichment analyses were performed by the KEGG, Reactome and Gene Ontology databases, followed by the construction of connectivity networks for the treatments for 2 h with 2.5 mM and 24 h with 25 mM by MetaCore. In the 2h treatment with 2.5 mM, biological processes associated with mitochondrial oxidative phosphorylation, metal ion homeostasis, unfolded protein response were enriched. In 2 h treatment with 25 mM, processes associated with cell cycle regulation. For the 24 h at 2.5 mM treatment, ALA modulated biological processes related to mitochondrial oxidative phosphorylation and cell differentiation. In the 24 h treatment with 25 mM, multiple pathways associated with ketone and aldehyde detoxification metabolic processes, oxidative stress-induced signaling, regulation of cell death, senescence, and pathways related to immune response were enriched. The analysis of connectivity networks corroborates the enrichment results and indicated that pathways such as Wnt / -catenin could be involved in ALA action. Identification of the complex network of ALA-modulated signaling pathways at different concentrations and treatment periods indicates which cellular processes may be involved in ALA's direct and indirect mechanisms of action and contributes to better understanding their role in the symptoms of diseases such as acute porphyrias.