Nas últimas décadas, observou-se uma melhoria de várias etapas do processo de fabricação de produtos biofarmacêuticos, que acabaram se traduzindo em aumento da capacidade de produção do setor. No entanto, a produção de produtos biofarmacêuticos envolve processos complexos e de baixo rendimento. Entre os principais fatores limitantes relacionados ao estabelecimento de uma plataforma de produção baseada em células de mamíferos estão o tempo prolongado e altos custos associados ao processo de obtenção de clones celulares de alta produtividade. Essas limitações estão intimamente relacionadas às metodologias comumente empregadas para a geração de transfectantes celulares estáveis, que envolvem eventos aleatórios de integração genômica de vetores de expressão, e o uso de protocolos de amplificação gênica, que estão associados, respectivamente, a eventos de inserção em sítios cromossômicos com atividade transcricional instável e reordenamentos genéticos drásticos. Uma alternativa que tem sido explorada nos últimos anos é baseada na inserção sítio-dirigida do cassete de expressão de interesse em regiões do genoma da célula hospedeira previamente associadas à uma atividade transcricional elevada e estável. A indústria biofarmacêutica tem mostrado um crescente interesse por este tipo de alternativa para a geração de clones superprodutores em células CHO, uma das plataformas de expressão mais utilizadas para a produção de biofármacos. Nesse sentido, existe uma demanda para se acumular conhecimento sobre regiões genômicas que suportam níveis estáveis e elevados de expressão gênica, e o objetivo principal deste trabalho consistiu na varredura desses “hotspots” genômicos na linhagem celular CHO-DG44. Nossa estratégia experimental envolveu: a) a construção e o uso de um vetor lentiviral bicistrônico de expressão, o pLV-spEYFP-DHFR, para a varredura de sítios genômicos em células CHO-DG44 associadas a uma expressão elevada e estável da proteína de interesse, e b) o uso de uma variante secretada da EYFP, a spEYFP, como proteína repórter, com o intuito de evitar um possível efeito deletério associado ao acúmulo citoplasmático da EYFP. Alternativamente, as células CHO-DG44 foram transfectadas com o mesmo vetor de expressão com o objetivo de se isolar clones celulares para servir como referência de níveis de expressão da spEYFP associados a números mais elevados de cópias genômicas do vetor de expressão. Explorando-se a transdução das células CHO-DG44 com o vetor pLV-spEYFP-DHFR, foram isolados e caracterizados oito clones celulares associados a eventos de integração genômica únicos do vetor de expressão. Estes clones celulares apresentaram níveis de expressão estáveis da proteína repórter por até dois meses, e comparáveis aos observados em clones celulares contendo de 35 a 45 cópias do mesmo vetor de expressão aleatoriamente integrado no genoma das células CHO-DG44. As nossas tentativas de mapeamento dos sítios genômicos de inserção através da técnica de DNA “walking” foram dificultadas por várias limitações associadas a fatores que limitaram a sensibilidade da técnica em detectar eventos únicos de inserção. Este trabalho foi a primeira tentativa de mapear sítios genômicos transcricionalmente ativos e estáveis em células CHO-DG44, e buscou, desta forma, complementar os achados envolvendo outras linhagens de células CHO importantes, a CHO-K1 e a CHO-S.

In recent decades, there has been an improvement of several stages of the manufacturing process of biopharmaceutical products, which eventually resulted in increased production capacity in the sector. However, the production of biopharmaceuticals involves complex and low-yield processes. Among the main limiting factors related to the establishment of a production platform based on mammalian cells are the prolonged time and high costs associated with the process of obtaining highly producing cell clones. These limitations are closely related to the methodologies commonly used for the generation of stable cellular transfectants, which involve random genomic integration events of expression vectors, and the use of gene amplification protocols, which are associated, respectively, with insertion events in chromosomal sites with unstable transcriptional activity and drastic genetic rearrangements. An alternative that has been explored in recent years is based on the site-directed insertion of the expression cassette of interest in regions of the host cell genome previously associated with a high and stable transcriptional activity. The biopharmaceutical industry has shown a growing interest in this type of alternative for the generation of super-producing clones in CHO cells, one of the most used expression platforms for the production of biopharmaceuticals. In this sense, there is a demand to accumulate knowledge about genomic regions that support stable and high levels of gene expression, and the main objective of this work consisted of screening for these genomic hotspots in the CHO-DG44 cell line. Our experimental strategy involved: a) the construction and use of a bicistronic lentiviral expression vector, the pLV-spEYFP-DHFR, for screening for genomic sites in CHO-DG44 cells associated with a high and stable expression of the protein of interest, and b) the use of a secreted variant of EYFP, spEYFP, as a reporter protein, in order to avoid a possible deleterious effect associated with cytoplasmic accumulation of EYFP. Alternatively, CHO-DG44 cells were transfected with the same expression vector in order to isolate cellular clones to serve as a reference for expression levels of spEYFP associated with higher numbers of genomic copies of the expression vector. Exploring the transduction of CHO-DG44 cells with the pLV-spEYFP-DHFR vector, we isolated and characterized eight cell clones associated with single genomic integration events of the expression vector. These cell clones presented stable levels of expression of the reporter protein for up to two months, and comparable to those observed in cell clones containing 35 to 45 copies of the same expression vector integrated into the CHO-DG44 cell genome. Our attempts to map the lentiviral integration sites through DNA “walking” were hampered by various limitations associated with factors which limited the sensitivity of the technique to detect single genomic insertion events. This work was the first attempt to identify genomic sites which are transcriptionally active and stable in CHO-DG44 cells, and it sought to complement findings involving other important CHO cell lines, such as CHO-K1 and CHO-S.