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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.87.2017.tde-21022017-113927
Documento
Autor
Nome completo
Gabriel Pinna Feliciano
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2016
Orientador
Banca examinadora
Azevedo, Anita Mitico Tanaka (Presidente)
Crespo, Joaquín Cabrera
Gonçalves, Viviane Maimoni
Título em português
Inovação no processo de fracionamento de plasma humano através do uso de cromatografia líquida de pseudoafinidade.
Palavras-chave em português
Cromatografia líquida
FIX
FVIII
Proteínas dependentes de vitamina K
Pseudoafinidade
Troca aniônica
Resumo em português
Neste trabalho mostramos que o método de purificação empregando a coluna ANX Sepharose FF, alternando eluições com CaCl2 (pseudoafinidade) e NaCl, permite obter concentrados do complexo protrombínico e do fator VIII em uma etapa cromatográfica. Testamos as colunas ANX e Q Sepharose FF, monolito QA e membrana Sartobind Q e os tampões citrato, MES e Bis-Tris. Empregando a ANX Sepharose FF e o tampão citrato as proteínas do complexo protrombínico eluiram com CaCl2 25 mM e o FVIII com NaCl 500mM. A recuperação da atividade de FVIII foi de cerca de 60% e o fator de purificação de 220 vezes. Na fração contendo as proteínas do complexo protrombínico foram identificadas por espectrometria de massas a presença de fibrinogênio, proteína C4 do complemento e C4b Binding Protein. A análise das frações mostra que a presença destas proteínas não é devido à variação da concentração de CaCl2, possivelmente se deve à difusão lenta destas através da resina. Mais de 99% das proteínas do plasma não são adsorvidas na coluna e podem ser purificadas em etapas posteriores.
Título em inglês
Innovation in human plasma fractionation process using liquid pseudo-affinity chromatography.
Palavras-chave em inglês
Anion-exchange
FIX
FVIII
Liquid chromatography
Pseudo-affinity
Vitamin K dependent proteins
Resumo em inglês
In this study we showed that the purification method employing the anion exchange column ANX Sepharose FF, and alternating CaCl2 (pseudoaffinity) and NaCl elutions, allows us to obtain concentrates of prothrombin complex proteins and factor VIII in a single chromatographic step. We tested the ANX, Q Sepharose FF and QA monolithic column and Sartobind Q membrane and the citrate, MES and Bis-Tris buffers. Using ANX Sepharose FF and the citrate buffer the prothrombin complex proteins eluted with 25 mM CaCl2 and FVIII with 500 mM NaCl. FVIII activity recovery was approximately 60% with a purification factor of 220. In the fraction containing the prothrombin complex proteins presence of fibrinogen, complement C4 and C4bBinding Protein were identified by mass spectrometry. Analysis of the fractions showed that their presence is not due to the variation of concentration of CaCl2, but possibly due to their slow diffusion through the resin. More than 99% of the plasma proteins are not adsorbed in the column and can be purified in following chromatographic steps.
 
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Data de Liberação
2021-02-21
Data de Publicação
2017-02-21
 
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