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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.87.2020.tde-17052022-095658
Document
Auteur
Nom complet
Zahid Ullah Khan
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2020
Directeur
Jury
Gidlund, Magnus Ake (Président)
Felinto, Maria Claudia França da Cunha
Fonseca, Henrique Andrade Rodrigues da
Gaspari, Elizabeth Natal de
Santos, Beate Saegesser
Toma, Henrique Eisi
Titre en portugais
Síntese e caracterização de quantum dots de emissão multicolorida: insight de um estudo com macrófagos RAW para o desenvolvimento de bionanossondas.
Mots-clés en portugais
imagem por fluorescência
macrófagos RAW
mecanismo de captação celular de QDs
Pontos quânticos
viabilidade celular
Resumé en portugais
O design e o desenvolvimento de uma nova geração de nanossondas são estritamente baseados no conhecimento preciso e prévio do comportamento entre células-nanopartículas, no movimento das partículas dentro e fora da célula, além de seu destino durante o percurso. A capacidade de manipular e superar as atividades de células e partículas são o pré-requisito para aprimorar a sensibilidade do diagnóstico e a eficiência terapêutica. O presente trabalho visou desvendar a potencialidade intrínseca de vários quatum dots (QDs) para o desenvolvimento futuro de nanossondas para o diagnóstico e monitoramento de distúrbios mediados por macrófagos como aterosclerose, osteoporose, doenças autoimunes, etc. Inicialmente, diferentes tipos de QDs de alta fotoluminescência, consistindo em ZnSe:Mn2 +, ZnSe:Eu2 +/Mn2 +@ZnS de emissão de multicores, CdSe/ZnS que emite cor a depender de seu tamanho e CdS/ZnS foram sintetizados por método organometálico de alta temperatura, e tornados solúveis em água pelo método de troca de ligantes, determinando suas propriedades físico-químicas e ópticas. Os QDs apresentaram boa estabilidade coloidal, boa dispersão em meios biológicos, intensa emissão fotoluminescente, tamanho pequeno entre 4-7 nm e alta cristalinidade. Foi avaliado o efeito dos QDs na linhagem celular de macrófago murino, RAW 264.7, e analisados qualitativa e quantitativamente pelo ultramicroscópio hiperespectral de campo escuro e de fluorescência CytoViva®, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e citometria de fluxo (FACS). Foram realizados ensaios de citotoxicidade como de anexina V/iodeto de propídio, MTT, exclusão por azul de tripano e ensaio de expressão de genes ligados à apoptose, onde não confirmaram qualquer efeito deletério óbvio dos QDs nas células, dentro do período de incubação estudado. A captação celular dos QDs foi muito eficiente e forneceu um sinal intenso de fluorescência que permitiu sua detecção facilmente através de microscopia de fluorescência e FACS. Além disso, a captação celular de QDs em baixas temperaturas (4°C) foi significativamente diminuída ou completamente interrompida em alguns casos, indicando uma preferência pelo mecanismo de endocitose dependente de energia. Foi também observado que os QDs aderem levemente e agregam à membrana celular antes de serem endocitadas por um caminho específico. Para elucidar as vias de endocitose, as células foram tratadas com QDs na presença de diferentes inibidores farmacológicos específicos da via: amilorida, óxido de fenilarsina, sacarose, metil-β-ciclodextrina e citocalasina D. Os resultados obtidos indicaram que a captação celular foi predominantemente facilitada via endocitose mediada por clatrina e/ou caveolae para todos os QDs, como esperado. Entretanto, no caso dos ZnSe:Eu2+/Mn2+@ZnS, (CdSe/ZnS)A e (CdSe/ZnS)B a internalização celular foi também executada por outros caminhos como micropinocitose ou fagocitose. Conclusivamente, os QDs apresentaram boa estabilidade coloidal, alta viabilidade celular, sinal de fluorescência aprimorado nas células e vias de entrada distintas em macrófagos RAW, sugerindo que os QDs aqui estudados são candidatos interessantes a serem explorados para o desenvolvimento de futuras nanossondas para diagnóstico de distúrbios mediados por macrófagos
Titre en anglais
Synthesis and characterization of multicolor-emitting quantum dots: insight into study in RAW macrophages for the development of bionanoprobe
Mots-clés en anglais
cell viability
cellular uptake mechanism of QDs
fluorescence imaging
Quantum dots
RAW macrophages
Resumé en anglais
The design and development of new generation bionanoprobe are strictly relied upon the precise and previous knowledge of particle-cell behavior, movement of a particle in and out of the cell, and the fate of particle in the course. The ability to manipulate and overcome the cell and particle activities are the prerequisite to enhance the diagnostic sensitivity and therapeutic efficiency. The current work aimed to unravel the intrinsic potentiality of various quantum dots (QDs) for the future development of bionanoprobe utilized in the diagnosis and monitoring of macrophages-mediated disorders such as atherosclerosis, osteoporosis, autoimmune diseases, etc. Initially, different types of highly photoluminescence QDs, consisting of ZnSe:Mn2+, multicolor-emitting ZnSe:Eu2+ /Mn2+@ZnS, color-tunable CdSe/ZnS, and CdS/ZnS were synthesized via a high-temperature organometallic method, rendered water-soluble by ligand exchange approach and determined their physicochemical and optical properties. The QDs presented good colloidal stability, good dispersion in a biological medium, intense photoluminescence emission, small size between 4-7 nm, and high crystallinity. The QDs were evaluated in a murine macrophage cell line, RAW 264.7 and analyzed qualitatively and quantitatively by CytoViva® Hyperspectral enhanced dark-field and dual-mode fluorescence (DMF) imaging system, transmission electron microscopy (TEM), and flow cytometry (FACS). Various cytotoxicity assays containing annexin V/propidium iodide assay, MTT assay, trypan blue exclusion assay, and assay for apoptosis-linked genes expression were performed and did not confirm any obvious deleterious effect of QDs in the cells, within the desired incubation period. The QDs presented efficient cellular uptake, which gave an intense fluorescent signal that enabled them to detect easily through the fluorescence microscopy and FACS. Besides that, the cellular uptake of QDs at a lower temperature (4ºC), was significantly depleted or completely halted in some cases, indicating a preferent mechanism by energy-dependent endocytosis. The QDs were observed to adhere to cell membranes singly and aggregately before being endocytosed by a specific pathway. To elucidate the endocytosis pathways, cells were treated with QDs in the presence of different pathway-specific pharmacological inhibitors: amiloride, phenylarsine oxide, sucrose, methyl-β- cyclodextrin and cytochalasin D. The obtained results indicated that the cellular uptake of all QDs was facilitated predominantly via clathrin and/or caveolae-mediated endocytosis, as expected. However, in the case of ZnSe:Eu2+/Mn2+@ZnS, (CdSe/ZnS)A and (CdSe/ZnS)B the cellular internalization was also executed by additional pathways of micropinocytosis or phagocytosis. Conclusively, the QDs presented good colloidal stability, high cell viability, enhanced fluorescence signal in cells, and distinct entry pathway in RAW macrophages, suggesting them interesting candidates to explore for the development of future bionanoprobe for diagnostic of macrophages-mediated disorders.
 
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Date de Libération
2024-05-16
Date de Publication
2022-08-09
 
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