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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.87.2020.tde-17052022-085457
Documento
Autor
Nombre completo
Natália Bonifácio Marteleto
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2020
Director
Tribunal
Piccoli, Rosane Aparecida Moniz (Presidente)
Bonomi, Antonio Maria Francisco Luiz José
Moraes, Ângela Maria
Oliveira, Ricardo Pinheiro de Souza
Silva, Luiziana Ferreira da
Tavassi, Ana Marisa Chudzinski
Título en portugués
Modelagem e otimização matemática do processo de produção daproteína recombinante Amblyomin-X pela bactéria Escherichia coli BL21(DE3) mutada
Palabras clave en portugués
Escherichia coli
Amblyomin-X
Análise de fluxos metabólicos
Modelagem matemática
Otimização de bioprocessos
Resumen en portugués
Amblyomin-X (Amblyomma cajennense inhibitor of Factor Xa) é uma proteína encontrada nas glândulas salivares do carrapato Amblyomma cajennense que inibe o Fator Xa da cascata de coagulação sanguínea. Ao ser expressa em Escherichia coli BL21(DE3), estudos mostraram que essa proteína induziu a apoptose em algumas células tumorais, tais como melanoma e carcinomas de pâncreas e renal. Com esses resultados, maiores quantidades de proteína foram requeridas e o desenvolvimento do processo de produção em maior escala foi necessário. A partir de um protocolo do processo de produção da proteína bem estabelecido, este trabalho de doutorado direto tem como objetivo otimizar a concentração celular obtida no momento anterior à indução da proteína heteróloga por meio da proposição de um modelo matemático fenomenológico não-estruturado que represente o processo e compreender, por meio da análise de fluxos metabólicos, a dinâmica do metabolismo E. coli no seu crescimento e na biossíntese da proteína. Trinta e oito ensaios foram realizados em biorreatores de 15 L no intuito de compreender os fenômenos envolvidos no processo de crescimento da bactéria e produção da proteína heteróloga de interesse. Desses ensaios, dez foram tomados para a proposição do modelo fenomenológico e ajustar os seus parâmetros. Um modelo fenomenológico do processo de produção da Amblyomin-X composto por 14 variáveis de estado, 1 equação de transporte de indutor do meio extracelular para o meio intracelular, 1 equação cinética de crescimento celular e 1 equação cinética de produção da proteína foi proposto e simulado utilizando o software Matlab®. O ajuste de parâmetros do modelo foi realizado em linguagem Fortran e validado Estatisticamente através do Teste-F. O modelo foi aprovado nesse teste estatístico e foi empregado para alimentar o otimizador em Matlab® visando maximizar a concentração celular no momento anterior à indução (produção de proteína associada ao crescimento). Empregando perfil de vazão de alimentação resultante da otimização, foi possível atingir a concentração de 30,25 g/L de células no biorreator. Para a compreensão do metabolismo da E. coli e análise de fluxos metabólicos, um ensaio (dentre os 38 demais) foi realizado com maior número de amostragens. A análise de fluxos metabólicos foi realizada utilizando o software Metatool e o software Matlab®, resultando em três conjuntos de modos de fluxos elementares. A partir desses modos elementares, foram geradas três diferentes fotografias, que representam o metabolismo da bactéria ao longo do processo de produção da proteína. A comparação entre tais fotografias mostra que não existem mudanças significativas na distribuição de fluxos nas vias do metabolismo central da bactéria ao longo do processo. A compreensão e a estimativa do fluxo de carbono a partir da velocidade de respiração microbiana também permitiu a proposição de outro modelo matemático para o monitoramento da produção de ácido acético em tempo real.
Título en inglés
Modeling and mathematical optimization of the production process of recombinant protein Amblyomin-X by the bacterium Escherichia coli BL21(DE3) mutated.
Palabras clave en inglés
Escherichia coli
Amblyomin-X
Analysis of metabolic flows
Bioprocess optimization
Mathematical modeling
Resumen en inglés
Amblyomin-X (Amblyomma cajennense inhibitor of Factor Xa) is a protein found in the salivary glands of the Amblyomma cajennense tick that inhibits Factor Xa from blood coagulation cascate. When expressed in Escherichia coli BL21(DE3), studies have shown that this protein induced apoptosis in some tumor cells, such as melanoma and pancreatic and renal carcinomas. With these results, greater amounts of protein were required and the development of the larger-scale production process was necessary. Based on a well-established protein production process protocol, this PhD work aims to optimize the cell concentration obtained prior to the induction of the heterologous protein by proposing an unstructured phenomenological mathematical model that represents the process and to understand, through the analysis of metabolic flux, the dinamics of E. coli metabolism in its growth and protein biosynthesis. Thirty-eigth tests were performed in 15 L bioreactors in order to understand the phenomena involved in the process of bacterial growth and production of the heterologous protein of interest. From these tests, ten were taken to propose the phenomenological model and adjust its parameters. A phenomenological model of the Amblyomin-X production process composed by 14 state variables, 1 transport equation of inducing extracellular media, 1 kinetic equation for protein production was proposed and simulated using Matlab® software. The adjustment of model parameters was performed in Fortran language and validated through F-Test. The model was approved in this statistical test and was used to feed the optimizer in Matlab® in order to maximize cell concentration in the moment prior induction (production of protein associated with growth). Using the feed flow profile resulting from the optimization, it was possible to reach 30.25 g/L cell concentration in the bioreactor. For the understanding of E. coli metabolism and analysis of metabolic fluxes, one test (among the remaining 38) was performed with a larger number of samples. The metabolic flux analysis was performed using the Metatool and Matlab® softwares, resulting in three sets of elementary flux modes. From these elementary modes, three diferente photographs were generated, wich represent the metabolism of the bacteria throughout the protein production process. The comparison between such photographs show that the are no significant changes in the distribution of fluxes in the pathways of the central metabolism of the bacteria throughout the process. The understanding and estimation of the carbon flux from the microbial respiration speed also allowed the proposition of another mathematical model for the monitoring of acetic acid production in real time.
 
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Fecha de Liberación
2024-05-16
Fecha de Publicación
2022-08-09
 
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