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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.87.2020.tde-17052021-084231
Documento
Autor
Nome completo
Laura Cristina Lima Diniz
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2020
Orientador
Banca examinadora
Silva Junior, Pedro Ismael da (Presidente)
Fernandes, Andrea Balan
Franzolin, Marcia Regina
Lotufo, Leticia Veras Costa
Sutti, Rafael
Tashima, Alexandre Keiji
Título em português
Biological evaluation of antimicrobial peptides isolated from the hemolymph of Triatoma infestans (HEMIPTERA:REDUVIIDAE) 
Palavras-chave em português
Triatoma infestans Sangue
Peptídeos antimicrobianos
Resumo em português
Resistência microbiana é um problema recorrente, que remonta das primeiras classes de antibióticos desenvolvidos, e que vem se tornando alarmante devido à velocidade e facilidade de surgimento de organismos (multi)resistentes. Com isso surge a preocupação com o quadro mundial e que vem associada à urgente necessidade de descoberta de novas moléculas antimicrobianas. Peptídeos antimicrobianos são moléculas que conseguem levar a morte células microbianas por mecanismos independentes de ligação sítio específicas, sendo interessantes moléculas alternativas aos antibióticos comerciais. Em trabalhos prévios do nosso grupo, foram identificados quatro peptídeos antimicrobianos da hemolinfa do inseto hematófago Triatoma infestans, identificados como Fibrinopeptídeo A humano, Triastina (antimicrobiano rico em glicina) e TRP1-TINF e TRP2-TINF (Peptídeos Relacionandos às Taquicininas). O trabalho apresentou três vertentes. Primeira: screening biológico para avaliação dos peptídeos supramencionados como possíveis novas drogas. Atividade anti parasíticas e antivirais foram avaliadas, aos quais as moléculas não se mostraram ativas, mesmo nas mais altas concentrações (FbPA 84 µM; Triastina 100 µM; TRP1-TINF 128 µM; TRP2-TINF 164 µM). Os peptídeos não apresentaram hemólise, mas apresentaram diferentes graus de toxicidade para células VERO (concentração inicial: 1000 M, 43% - FbPA, 16% Triastina e TRP11-TINF e 10% - TRP2-TINF). Nos ensaios in vivo em modelos de microscopia intravital, em [200 µM], o FbPA não induziu alterações de microcirculação, Triastina foi capaz de interromper o fluxo sanguíneo sem a formação de trombos e TRP1-TINF e TRP2-TINF apresentaram um padrão pró inflamatório. Em modelo zebrafish, [200 µM], onde o FbPA não pode ser testado, o peptídeo Triastina foi letal para 100% da amostragem de embriões em 48 hpf, TRP1-TINF foi letal para 100% da amostragem em 72 hpf e TRP2-TINF apresentou letalidade para 35% da amostragem, sendo que a maioria dos embriões vivos apresentaram malformações. Na avaliação de mecanismo de ação, o único peptídeo capaz de interagir com DNA foi o FbPA [≥60µM]. Na segunda vertente foi verificado o mecanismo pelo qual uma molécula humana se encontra presente na hemolinfa do inseto em questão. O FbPA sintético foi acoplado com o fluoróforo FITC e foi fornecido juntamente com a alimentação aos insetos. A fluorescência da hemolinfa dos insetos ingurgitados com a alimentação marcada foi comparada com a hemolinfa de insetos não alimentados, se mostrando significativa, sendo possível confirmar que a presença do FbPA humano na hemolinfa do inseto ocorre através de absorção intestinal. E finalmente, avaliando os criptídeos, foram identificados vários fragmentos com atividade antimicrobiana no intestino do inseto, provenientes de digestão da hemoglobina murina. Em conclusão o trabalho geral demonstrou que os peptídeos testados apresentam interessante atividade antimicrobiana e são potenciais novas drogas, mas necessitam de melhorias em relação a sua toxicidade. Foram demonstradas também duas fontes alternativas de antimicrobianos para insetos, sendo uma através de fragmentos provenientes de absorção intestinal e outra através da digestão do sangue ingerido.
Título em inglês
Biological evaluation of antimicrobial peptides isolated from the hemolymph of Triatoma infestans (HEMIPTERA:REDUVIIDAE) [Thesis].
Palavras-chave em inglês
Triatoma infestans
Antimicrobial peptides
Blood
Resumo em inglês
Microbial resistance is a recurring problem, which dates back to the first classes of antibiotics developed, and which has become alarming due to the speed and ease of emergence of (multi)resistant organisms. Thus rises the concern with the global scenario and that comes associated with the urgent need to development of new antimicrobial drugs. Antimicrobial peptides are molecules that manage to kill microbial cells by independent mechanisms of site-specific binding, being interesting molecules alternative to commercial antibiotics. In previous works of our group, four antimicrobial peptides from the hemolymph of the hematophagous insect Triatoma infestans were identified as human fibrinopeptide A, Triastine (glycine-rich antimicrobial) and TRP1-TINF and TRP2-TINF (Tachykinin-Related Peptides). The work presented three aspects. First: biological screening to evaluate the aforementioned peptides as possible new drugs. Anti-parasitic and antiviral activities were evaluated, to which the molecules were not active, even at the highest concentrations (FbPA 84 µM; Triastin 100 µM; TRP1-TINF 128 µM; TRP2-TINF 164 µM). The peptides did not presented hemolysis, but showed different degrees of toxicity for VERO cells (initial concentration: 1000 µM, 43% - FbPA, 16% Triastina e TRP11-TINF e 10% - TRP2-TINF). In in vivo tests on intravital microscopy models, at [200 µM], FbPA did not induce changes in microcirculation, Triastine was able to interrupt blood flow without the formation of thrombi and TRP1-TINF and TRP2-TINF showed a pro-inflammatory pattern. In a zebrafish model, [200 µM], FbPA could not be tested, the Triastine peptide was lethal for 100% of the embryo sampling at 48 hours post-fertilization, TRP1-TINF was lethal for 100% of the sampling at 72 hpf and TRP2-TINF showed lethality for 35% of the sample, with the majority of other embryos having malformations. In the evaluation of the mechanism of action, the only peptide capable of interacting with DNA was FbPA [≥60µM]. In the second part, the mechanism by which a human molecule is present in the hemolymph of the insect in question was verified. The synthetic FbPA was coupled with the FITC fluorophore and was supplied together with the insect feed. The fluorescence of the hemolymph of engorged insects with marked feeding was compared with the hemolymph of non-fed insects, showing to be significant, being possible to confirm that the presence of human FbPA in the insect's hemolymph occurs through intestinal absorption. Finally, evaluating the cryptids, several fragments with antimicrobial activity were identified in the insect's intestine, resulting from digestion of murine hemoglobin. In conclusion, the general work demonstrated that the peptides tested present interesting antimicrobial activity and are potential new drugs, but need improvements due to the general toxicity presented. Two alternative sources of antimicrobials for insects were also demonstrated, one through fragments from intestinal absorption and the other through the digestion of ingested blood.
 
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Data de Liberação
2023-05-17
Data de Publicação
2022-05-30
 
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