Streptococcus pneumoniae (pneumococo) é uma das principais causas de pneumonia, meningite e sepse. Aproximadamente 400.000 crianças menores de 5 anos morrem anualmente por infecções causadas por pneumococo ao redor do mundo. A proteína A de Superfície de Pneumococo (PspA) é um antígeno bem caracterizado, que confere proteção em modelos animais, representando uma boa alternativa para as vacinas conjugadas atuais. Entretanto, poucos adjuvantes de baixo custo foram propostos até hoje. Em trabalhos anteriores, nosso grupo mostrou que a vacina celular pertussis (wP) é um bom adjuvante quando testada em combinação a PspA, induzindo altos níveis de anticorpos e proteção contra desafios invasivos e de colonização nasal por pneumococo em camundongos. Estes resultados suportam estratégias para o desenvolvimento de vacinas duplas para a proteção contra pertussis e pneumococo. Neste trabalho, duas estratégias para a composição de vacinas duplas foram testadas. Na primeira, o antígeno PspA4Pro (região N-terminal de PspA do clado 4) foi expresso na linhagem vacinal de B. pertussis, para a produção de uma vacina recombinante inativada (wP^PspA4Pro). PspA4Pro foi expresso em fusão com a porção N-terminal da adesina FHA (Hemaglutinina Filamentosa A) de B. pertussis, visando o direcionamento para a superfície da bactéria. A expressão foi confirmada por western-blot e diferentes clones foram utilizados para a produção de vacinas wP^PspA4Pro, através da inativação com formaldeído. A imunização de camundongos BALB/c com diferentes preparações de vacinas wP^Pspa4Pro, em até três doses, induziu baixos níveis de IgG anti-PspA4Pro no soro. Além disso, não foi observada a proteção dos camundongos vacinados após o desafio letal com pneumococo. Desta forma, a vacina recombinante wP^PspA4Pro, não se mostrou eficaz contra infecções por pneumococo. A segunda estratégia consistiu no uso de um sistema de entrega de antígenos baseado na toxina adenilato cliclase (CyaA) de B. pertussis. A CyaA é capaz de se ligar a receptores presentes em células apresentadoras de antígeno, modulando a resposta imune contra antígenos associados. Diferentes fragmentos de PspA dos clados 2 e 4 (F1, F2, F4 e F5), além das regiões N-terminais completas (PspA2Pro e PspA4Pro) foram clonados em uma região permissiva do gene que codifica a CyaA. As proteínas recombinantes foram expressas em E. coli e purificadas por métodos cromatográficos. Camundongos BALB/c foram imunizados em experimentos independentes com as diferentes proteínas CyaA-PspA. As proteínas CyaA-PspA4-F4 e CyaA-PspA4-F5 foram mais imunogênicas induzindo níveis de mais altos de IgG anti-PspA4Pro quando comparadas às proteínas CyaA-PspA4-F1 e CyaA-PspA4-F2. Além disso, 100 % dos camundongos vacinados com a proteína CyaA-PspA4-F5 foram protegidos contra o desafio letal com pneumococo, indicando que este antígeno é um candidato promissor para o desenvolvimento de uma vacina. Assim, as proteínas CyaA-PspA2-F5 e CyaA-PspA4-F5 foram testadas em experimentos adicionais e os resultados mostraram a indução de altos níveis de anticorpos e proteção dos camundongos contra desafios com pneumococo expressando PspAs do clado 2 e 4, respectivamente. A combinação das duas proteínas foi protetora contra os dois desafios, sendo, portanto, uma formulação com potencial de cobertura de isolados mais abrangente. O potencial protetor contra infecções por B. pertussis ainda deve ser avaliado.

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is a major cause of pneumonia, meningitis and sepsis. About 400,000 children under the age of 5 die each year from pneumococcal infections worldwide. Pneumococcus Surface Protein A (PspA) is a well-characterized antigen that confers protection in animal models and represents a good alternative to current conjugate vaccines. However, few low-cost adjuvants have been proposed to date. In previous studies, our group has shown that the whole cell pertussis vaccine (wP) is a good adjuvant when tested in combination with PspA, inducing high antibody levels and protection against invasive challenges and pneumococcal nasal colonization in mice. These results support strategies for the development of combined vaccines for protection against pertussis and pneumococcus. In this work, two strategies for the composition of dual vaccines were tested. In the first, the PspA4Pro antigen (N-terminal region of PspA from clade 4) was expressed in the Bordetella pertussis vaccine strain for the production of an inactivated recombinant vaccine (wP^PspA4Pro). PspA4Pro was expressed in fusion with the N-terminal portion of B. pertussis FHA (Filamentous hemagglutinin A) adhesin to target the surface of the bacterium. Expression was confirmed by western blot and different clones were used for the production of wP^PspA4Pro vaccines by inactivation with formaldehyde. Immunization of BALB/c mice with different wP^Pspa4Pro vaccine preparations, at up to three doses, induced low levels of anti-PspA4Pro IgG in the sera. In addition, protection of vaccinated mice against a lethal pneumococcal challenge was not observed. Thus, the wP^PspA4Pro recombinant vaccine was not effective against pneumococcal infections. The second strategy was to use an antigen delivery system based on B. pertussis adenylate cyclase toxin (CyaA). CyaA is capable of binding to receptors present on antigen presenting cells, modulating the immune response against associated antigens. Different PspA fragments from clades 2 and 4 (F1, F2, F4 and F5), as well as complete N-terminal regions (PspA2Pro and PspA4Pro) were cloned into a permissive region of the CyaA gene. Recombinant proteins were expressed in E. coli and purified by chromatographic methods. BALB/c mice were immunized in independent experiments with different CyaA-PspA proteins. CyaA-PspA4-F4 and CyaA-PspA4-F5 proteins were more immunogenic, inducing higher levels of anti-PspA4Pro IgG when compared to CyaA-PspA4-F1 and CyaA-PspA4-F2 proteins. In addition, 100 % of mice vaccinated with the CyaA-PspA4-F5 protein were protected against the lethal pneumococcal challenge, indicating that this antigen is a promising candidate for vaccine development. Thus, the CyaA-PspA2-F5 and CyaA-PspA4-F5 proteins were tested in additional experiments and the results showed the induction of high antibody levels and protection of mice against challenges with pneumococcal strains expressing PspAs from clade 2 and 4, respectively. The combination of the two proteins was protective against both challenges and was therefore a formulation with potential broader coverage of isolates. The protective potential against B. pertussis infections has yet to be evaluated.