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Master's Dissertation
DOI
10.11606/D.87.2011.tde-15092011-133629
Document
Author
Full name
Cátia Taniela Perciani
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2011
Supervisor
Committee
Tanizaki, Martha Massako (President)
Fukasawa, Lucila Okuyama
Ruiz, Rita de Cássia
Title in Portuguese
Polissacarídeo sorotipo 6B de Streptococcus pneumoniae (PS6B) e proteína de superfície pneumocócica A (PspA): métodos de conjugação e avaliação da reposta imune.
Keywords in Portuguese
Streptococcus
Doenças infecciosas
Imunização
Polissacarídeo
Vacinas
Abstract in Portuguese
Streptococcus pneumoniae é a maior causa de doenças infecciosas invasivas. As vacinas conjugadas, ao contrário das vacinas polissacarídicas, se mostram eficazes na indução de uma resposta protetora em crianças menores de 2 anos de idade. Entretanto, apesar do sucesso na redução dos casos de doenças pneumocócicas, publicações recentes têm mostrado um aumento nos casos de doença por sorotipos de S. pneumoniae não inclusos nas vacinas conjugadas atualmente licenciadas. Com o objetivo de evitar a substituição dos sorotipos prevalentes e aumentar a cobertura vacinal, nosso projeto prevê a introdução de uma proteína de superfície do pneumococo como carreador em uma vacina conjugada. A Proteína de Superfície Pneumocócica A (PspA), por ser conservada entre diversos sorotipos e por sua alta imunogenicidade, foi escolhida para constituir o conjugado, juntamente com o Polissacarídeo Capsular de S. pneumoniae sorotipo 6B (PS6B), um sorotipo de elevada prevalência no Brasil. Também foi avaliada a influência de diferentes espaçadores entre a proteína carreadora e o PS sobre a resposta imune induzida. Estudos envolvendo diferentes condições reacionais tiveram como objetivo o estabelecimento de um protocolo de conjugação com elevado rendimento. A substituição do ativador EDAC (hidrocloreto de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida), comumente empregado na ativação do grupo carboxila da proteína, pelo DMT-MM (cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolino) foi capaz de aumentar significativamente o rendimento reacional, o qual passou de menos de 10% para aproximadamente 50%. A proteção com formaldeído dos grupos lisinas da PspA aumentou a especificidade da reação de conjugação, com consequente aumento no rendimento reacional. A PspA modificada manteve a mesma estrutura secundária apresentada pela PspA nativa (análise por dicroísmo circular - CD) bem como sua imunogenicidade (título de anticorpos, capacidade de deposição de complemento e atividade opsonofagocítica). Apesar das análises por CD mostrarem que a conjugação alterou a estrutura secundária da PspA, ensaios imunológicos mostraram que essa desestruturação não afetou a sua capacidade de induzir uma resposta imune protetora. A resposta anti-PspA e anti-PS6B induzida pelo conjugado mostrou-se dose dependente, muito embora o PS6B tenha se comportado como um antígeno pouco imunogênico.
Title in English
Polysaccharide serotype 6B of Streptococcus pneumoniae (PS6B) and pneumococcal surface protein A (PspA): conjugation methods and immune response evaluation.
Keywords in English
Streptococcus
Immunization
Infectious disease
Polysaccharide
Vaccine
Abstract in English
Streptococcus pneumoniae is the main cause of invasive infectious diseases. Unlike polysaccharide (PS) based vaccines, conjugate vaccines have shown to protect children less than 2 years old. However, regardless of the success in reducing pneumococcal disease, recent reports have shown an increase in the rate of disease caused by serotypes not included in licensed conjugate vaccines. In order to avoid serotype replacement, our project proposes to test a surface exposed pneumococcal protein as carrier. Pneumococcal Surface Protein A (PspA), a conserved protein among various serotypes, and highly immunogenic was chosen to take part in the conjugate together with the Polysaccharide Serotype B of Streptococcus pneumoniae (PS6B), a serotype of high incidence in Brazil. In this sense, studies involving different reactional conditions were aimed at stablishing a high yield conjugation protocol. Also, the influence of different spacer between carrier protein and polysaccharide were evaluated on immune response. The replacement of EDAC (1-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride), usually used in the activation of protein carboxyl groups, to DMT-MM (4-[4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl]-4-methylmorpholinium chloride), was able to significantly increase the reactional yield from less than 10% to approximately 50%. The protection of lysines groups of PspA with formaldehyde increased conjugation specificity, with subsequent increase in reactional yield. Modified PspA maintained the same secondary structure of native PspA (circular dichroism analyses - CD) as well as its immunogenicity (antibody titers, deposition of complement and opsonophaghocytic activity). Despite circular dichroism analyses have shown changes in PspA secondary structure, immunological tests proved that this alteration did not affect its ability in inducing a protective immune response. Anti-PspA and anti-PS6B responses proved to be dose dependent, although PS6B acted as a poor immunogenic antigen in mice.
 
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Publishing Date
2011-09-22
 
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