A terapia fotodinâmica (Photodynamic Therapy - PDT) é um método de tratar neoplasias aprovado para uso clínico em diversos países. Seu mecanismo de ação baseia-se na interação entre luz, oxigênio molecular e um agente fotossensibilizante. A característica singular da PDT é a capacidade de induzir resposta imunológica adaptativa contra recidivas tumorais e/ou metástases, determinando uma resposta específica, de longo prazo, para a neoplasia tratada. O presente estudo teve o objetivo de desenvolver um novo tratamento adjuvante para o melanoma baseando-se nos efeitos da Terapia Fotodinâmica sobre o sistema imunológico. Como objetivos específicos, o estudo visa estabelecer um protocolo de coleta e processamento de amostras de melanoma murino B16 -F10 e serem tratadas in vitro com a terapia fotodinâmica, baseada no Azul de Metileno (AM) e Laser vermelho, produzindo assim a vacina e testar a sua eficácia para imunização de camundongos contra o melanoma B16-F10 e testar sua eficácia para o tratamento de melanoma B16-F10 em camundongos. Três experimentos foram realizados sequencialmente, os quais estão organizados em 3 capítulos. No primeiro experimento (CAPÍTULO 2) são abordados os procedimentos in vitro realizados para, utilizando a PDT-AM, ser obtido o lisado de células do melanoma B16-F10, contendo variados antígenos tumorais e DAMPs (do inglês: Damage Associated Molecular Patterns), podendo assim ser utilizado como uma vacina terapêutica. Com este propósito foram realizados diversos protocolos onde se variou a concentração do AM, assim como a dose de energia com o qual as células foram irradiadas com o laser, sendo então realizadas diversas técnicas analíticas para a interpretação dos resultados e determinação do protocolo mais apropriado. Demonstrou-se que a PTD-AM tem efeito antineoplásico in vitro nos melanomas murinos B16-F10, reduzindo a viabilidade celular e induzindo a morte por apoptose, que aumenta de forma diretamente proporcional à concentração do agente fotossensibilizante e a dose de energia irradiada. A PDT-AM é um método promissor no tratamento do melanoma maligno, sendo as concentrações do AM e as doses de energia aqui estabelecidas servindo de base para futuros estudos. Ademais, concluiu-se que a dose de 2 µg/ml do azul de metileno associado a irradiação do laser com dose de energia em 100,8 J, é o regime de tratamento ótimo, onde há cerca de 50 de células em morte celular por apoptose e com um índice de viabilidade celular após 24h de menos de 20%, para produção do lisado tumoral a ser utilizado como vacina terapêutica. No segundo experimento (CAPÍTULO 3) foram avaliados os efeitos da imunização com lisado de células do melanoma B16-F10, produzido in vitro com a PDT-AM, sobre a progressão do volume do melanoma B16 -F10 em camundongos. Avaliou-se também os efeitos da imunização com lisado de células do melanoma B16-F10 sobre os órgãos do sistema imunológico (Baço e Linfonodo), e sobre a população de linfócitos T CD3+ dos órgãos do sistema imunológico (Baço e Linfonodo). Como resultados, demonstrou-se a capacidade imunogênica de lisados de células tumorais da linhagem de melanoma murino B16-F10 produzidos in vitro com a PDT-AM, assim como dos lisados produzidos por congelamento. A aplicação do lisado antes da inoculação tumoral foi capaz de atenuar, atrasar e, em parte dos animais, impedir a progressão do melanoma B16-F10 em camundongos BALB/c, além de induzir alterações em baço e linfonodo regional, caracterizando resposta por linfócitos T contra as células neoplásicas. Já no terceiro experimento (CAPÍTULO 4), buscou-se estudar o efeito do lisado de células do melanoma B16-F10, removido parcialmente por cirurgia, após inoculação em camundongos C57 BL/6, como vacina antitumoral terapêutica. Da mesma forma, avaliaram-se os efeitos do lisado de células tumorais sobre a progressão tumoral e sobre os órgãos do sistema imunológico (Baço e Linfonodo) e sobre a população de linfócitos T CD3+ nos órgãos do sistema imunológico (Baço e Linfonodo). Como resultados, demonstrou-se a capacidade imunogênica de lisados de células do melanoma B16-F10, removido parcialmente por cirurgia, após inoculação em camundongos C57 BL/6, para então ser submetido, in vitro, a PDT-AM, assim como dos lisados por produzidos por congelamento. A aplicação do lisado como vacina terapêutica foi capaz de atenuar a progressão do melanoma B16-F10 nestes camundongos, além de induzir alterações em baço e linfonodo regional, caracterizando resposta por linfócitos T contra as células neoplásicas. Em conclusão, o presente trabalho utilizou a terapia fotodinâmica baseado no Azul de Metileno e Laser de diodo emitindo espectro vermelho para produzir lisado de células tumorais do melanoma murino B16-F10, sendo este lisado utilizado para indução de resposta imunológica antitumoral específica. Os resultados encontrados mostram que a técnica foi capaz de gerar efeitos sobre o sistema imunológico, sendo capaz de, ao menos, atenuar a velocidade de progressão do melanoma B16-F10 em camundongos.

Photodynamic Therapy (PDT) is a method of treating neoplasms approved for clinical use in several countries. Its mechanism of action is based on the interaction between light, molecular oxygen and a photosensitizing agent. The unique feature of PDT is the ability to induce an adaptive immune response against tumor recurrence and / or metastasis, determining a long-term, specific response to the treated neoplasm. The present study aimed to develop a new adjuvant treatment for melanoma based on the effects of Photodynamic Therapy on the immune system. As specific objectives, the study aims to establish a protocol for the collection and processing of B16-F10 murine melanoma samples to be treated in vitro with photodynamic therapy based on Methylene Blue (MB) and Red Laser, obtaining a vaccine and then test the vaccine´s efficacy for the immunization of mice against B16-F10 melanoma and to test the vaccine´s efficacy for the treatment of B16-F10 melanoma in mice. Three experiments were performed sequentially, which are organized in 3 chapters. In the first experiment (CHAPTER 2) the procedures performed for the use of PDT-MB, producing the lysate of B16-F10 melanoma cells containing various tumor antigens and DAMPs (Damage Associated Molecular Patterns) and can therefore be used as a therapeutic vaccine. For this purpose, several protocols were performed in which the concentration of MB was varied, as well as the dose of energy with which the cells were irradiated with the laser, and several analytical techniques were performed for the interpretation of results and determination of the most efficient and appropriate protocol. PTD-MB has been shown to have an antineoplastic effect in vitro on murine B16-F10 melanomas, reducing cell viability and inducing death by apoptosis, which increases directly proportional to the concentration of the photosensitizing agent and the dose of irradiated energy. PDT-MB is a promising method in the treatment of malignant melanoma, with MB concentrations and energy doses being established as the basis for future studies. In addition, it was concluded that the dose of 2 µg / ml of methylene blue associated with laser irradiation with energy dose at 100.8 J is the optimal treatment regimen, where there are about 50% cells in cell death by apoptosis and with a cell viability index after 24h of less than 20%, for the production of the tumor lysate to be used as a therapeutic vaccine. In the second experiment (CHAPTER 3) the effects of immunization with lysate of B16-F10 melanoma cells, produced in vitro with PDT-MB, on the progression of melanoma volume B16-F10 in mice. The effects of immunization with B16-F10 melanoma cell lysate on the organs of the immune system (Spleen and Lymph Node), and on the population of CD3 + T lymphocytes of the organs of the immune system (Spleen and Lymph Node) were also evaluated. As results, the immunogenicity of tumor cell lysates from the murine melanoma line B16-F10 produced in vitro with PDT-MB, as well as lysates by freeze-thaw. The lysate application prior to tumor inoculation was able to attenuate, delay and, in part of the animals, prevent the progression of B16-F10 melanoma in BALB/c mice, in addition to inducing changes in spleen and regional lymph node, characterizing response by T lymphocytes against neoplastic cells. In the third experiment (CHAPTER 4), we aimed to study the effect of B16-F10 melanoma cell lysate, partially removed by surgery, after inoculation in C57BL/6 mice, as a therapeutic antitumor vaccine. Likewise, the effects of tumor cell lysate on tumor progression and on the organs of the immune system (Spleen and Lymph Node) and on the CD3 + T lymphocyte population in the organs of the immune system (Spleen and Lymph Node) were evaluated. As results, it was demonstrated the immunogenic capacity of B16-F10 melanoma cell lysates, partially removed by surgery, after inoculation in C57BL/6 mice, and subjected to in vitro PDT-MB, as well as lysates by produced by freeze and thaw cycles. The lysate application as a therapeutic vaccine was able to attenuate the progression of B16-F10 melanoma in these mice, in addition to inducing changes in spleen and regional lymph node, characterizing response by T lymphocytes against neoplastic cells. In conclusion, the present work used photodynamic therapy based on Methylene Blue and Diode Laser emitting red spectrum to produce lysate of murine melanoma B16-F10 tumor cells, this lysate being used to induce specific antitumor immune response. The results show that the technique was able to generate effects on the immune system, being able to at least mitigate the rate of progression of B16-F10 melanoma in mice.