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Thèse de Doctorat
DOI
10.11606/T.87.2009.tde-13082009-103143
Document
Auteur
Nom complet
Paula Fratini
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2009
Directeur
Jury
Strauss, Bryan Eric (Président)
Carramaschi, Lygia da Veiga Pereira
Chammas, Roger
Martins, Elizabeth Angelica Leme
Vasques, Luciana dos Reis
Titre en portugais
Expressão do vetor retroviral pCLPG medido em receptores de transplante de medula óssea.
Mots-clés en portugais
Biotecnologia
Câncer
Expressão gênica
Neoplasias
Oncogenes
Retroviridae
Transplante de medula óssea
Vírus
Resumé en portugais
O vetor retroviral é uma ferramenta de transferência gênica largamente utilizada em ensaios de laboratório e em protocolos clínicos. Nosso laboratório desenvolveu um novo vetor, chamado pCLPG, com expressão viral sob comando de p53, um supressor de tumor e um ativador indutível de transcrição, com alvo de estabelecer um vetor com alta expressão. O sistema pCLPG demonstrou um nível de expressão superior ao vetor não modificado em ensaios em cultura de células. Neste projeto, nosso objetivo foi caracterizar a expressão do vetor pCLPG in vivo, utilizando um modelo animal de transdução de células da medula óssea (CMO) do camundongo C57BL/6 seguido por transplante em animais recipientes previamente irradiados para abolir o sistema hematopoiético. Visando observar a expressão sustentada do transgene in vivo, padronizamos o transplante de CMO seriado, transdução do vetor retroviral, realizamos análise do gene repórter eGFP por citometria de fluxo e análise por real time PCR, além da observação de outros tecidos como baço, timo, sangue periférico. Realizamos também analises hematológicas nos animais transplantados para observação de possíveis efeitos adversos relacioanados com a presença do retrovírus. Com estes ensaios não foi observado uma diferença significante entre o desempenho do vetor parental pCLeGFP e o pCLPGeGFP. Tanto o número de células eGFP positivas quanto a expressão do gene repórter diminuíram ao longo do processo de transplante seriado. Expressão foi observada em 3-4%, 2-3% ou 2-3% das celulas recuperadas da medula ossea dos recipientes primários, secundários ou terciários de CMO transduzida com o vetor pCLeGFP, mas não no sangue periférico, timo ou baço. Semelhantemente, células eGFP-positivas (6-7%, 4-4,5% ou 3-3,5%) foram observadas após transplante seriado somente na medula óssea de animais recipientes de CMO transduzida com o vetor pCLPGeGFP. Entretanto, sangue periférico foi recuperado dos recipientes e tratado com 5-asacitidina, proporcionando a indução de expressão de eGFP a partir de ambos os vetores em aproximadamente 4% das células, implicando que o silenciamento viral poderia estar relacionado com processos de metilação. Este estudo demonstrou que as modificações no promotor do vetor pCLPG não foram suficientes para evitar silenciamento de expressão viral no modelo utilizado.
Titre en anglais
Assessment of pCLpG retroviral vector expression in vivo utilizing serial transplantation of transduced bone marrow cells.
Mots-clés en anglais
Biotechnology
Bone marrow transplantation
Cancer
Gene expression
Neoplasms
Oncogenes
Retroviridae
Virus
Resumé en anglais
The retroviral vector is a widely used gene transfer tool in both laboratory assays and clinical trials. Our laboratory developed a new vector, called pCLPG, with viral expression under the command of p53, a tumor suppressor and inducible activator of transcription, with the aim of establishing a vector with high level expression. The level of expression offered by the pCLPG system was superior to the non-modified vector in cell culture assays. In this project, our objective was to characterize the expression of the pCLPG vector in vivo utilizing an animal model where bone marrow cells (BMC) from C57BL/6 mice are transduced and then transplanted in recipient animals that have been previously irradiated in order to abolish the hematopoietic system. With the aim of observing sustained transgene expression in vivo, we standardized serial BMC transplantation, transduction with retroviral vectors and analyzed the eGFP reporter gene by flow cytometry and real time PCR, and also studied other tissues, such as spleen, thymus and peripheral blood. We also performed hematologic analyses in the transplanted animals in to observe possible adverse events related to the presence of the retrovirus.These assays did not reveal a significant difference between the performances of the parental pCLeGFP vector and pCLPGeGFP. Both the number of eGFP-positive cells and the intensity of reporter gene expression diminished during the serial transplant process. Expression was observed in 3-4%, 2-3% or 2-3% of cells recovered from bone marrow of the primary, secondary or terciary recipients of BMC transduced with the pCLeGFP vector, but not in peripheral blood, thymus or spleen. Similarly, eGFP-positive cells (6-7%, 4-4.5% or 3-3.5%) were observed after serial transplantation only in the bone marrow of animals that received BMC transduced with the pCLPGeGFP vector. However, peripheral blood was recovered from recipients and treated with 5-azacytidine, inducing the expression of eGFP from both vectors in approximately 4% of these cells, implying that viral silencing may have been related with methylation. This study demonstrated that the modifications in the promoter of the pCLPG vector were not sufficient to avoid silencing of viral expression in this model.
 
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Date de Publication
2009-08-26
 
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