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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.87.2019.tde-13012021-145236
Documento
Autor
Nome completo
Giovanni Victorio Cerruti
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2019
Orientador
Banca examinadora
Santos, André Luis Wendt dos (Presidente)
Cesarino, Igor
Duque, Ana Sofia Roldão Lopes Amaral
Navarro, Bruno Viana
Título em português
Elucidação das respostas bioquímicas mediadas por L-arginina durante o desenvolvimento de embriões somáticos de Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze
Palavras-chave em português
Araucaria angustifólia
Embriogênese somática
Óxido nítrico
Poliaminas
Resumo em português
A Araucaria angustifolia é uma conífera endêmica do Brasil e devido à sua exploração predatória, a espécie ocupa hoje apenas 2% do seu território original. Técnicas biotecnológicas como a embriogênese somática (ES) podem ser associadas a programas de melhoramento genético e conservação de germoplasma de espécies em situação de vulnerabilidade ou ameçadas de extinção. A similaridade entre a embriogênese zigótica e somática tem sido utilizada para estudos visando o aprimoramento do cultivo in vitro dos embriões somático, bem como para melhor compreensão acerca dos mecanismos moleculares e bioquímicos que regulam a embriogênese. Nesse contexto, a homeostase redox é um fator determinante para o correto desenvolvimento embrionário. Dentre os eventos envolvidos no balanço oxidativo, está o metabolismo de poliaminas (PAs) e óxido nítrico (ON), cujas vias metabólicas são associadas ao aminoácido L-arginina. O presente trabalho teve como objetivo analisar a influência do aminoácido L-arginina na biossíntese de ON, PAs e aminoácidos durante a fase de transição entre a proliferação das massas suspensor embrionárias e o desenvolvimento inicial dos embriões somáticos (pré-maturação) em culturas embriogênicas responsivas (R) e bloqueadas (B) ao desenvolvimento embrionário. Foram analisados: I) emissão de ON endógeno e a dinâmica de proliferação celular em suspensões celulares suplementadas com a L-arg (5 e 10 mM); II) perfil de PAs livres e aminoácidos (AAs); e III) a influência da manipulação do ambiente redox no desenvolvimento dos embriões utilizando glutationa (GSH) e butionina sulfoxilamina (BSO). Posteriormente à pré-maturação (14 dias), nas suspensões celulares suplementadas com 5 e 10 mM de L-arginina os níveis de ON observados na linhagem B foram maiores nos grupos suplementados com L-arginina em comparação ao controle, em contrapartida a linhagem R apresentou maior emissão no grupo controle e queda gradual nos tratamentos. Frente às condições de maturação, após 60 dias de cultivo, o tratamento suplementado com 5 mM de L-arginina apresentou o maior número de embriões no estádio I e II de desenvolvimento. Durante a fase de proliferação, na biossíntese de PAs observou-se um incremento no conteúdo de putrescina (Put) e espermina (Spm) nos grupos da linhagem B suplementados com L-arginina, enquanto que para ambas as linhagens a biossíntese de espermidina (Spd) permaneceu constante. Em relação à manipulação do ambiente redox, o grupo controle apresentou maior formação de embriões. Os resultados aqui obtidos fornecem informações relevantes acerca da interação entre o metabolismo da L-arginina e embriogênese somática, onde a suplementação de 5 mM do aminoácido favoreceu a geração de embriões, fato associado à diminuição no conteúdo de ON, bem como outros comportamentos bioquímicos aqui observados, como o acúmulo da poliamina putrescina e a variação no conteúdo de aminoácidos. O conhecimento oriundo do presente trabalho fornece novas abordagens para o aprimoramento das condições artificiais aplicadas no processo de embriogênese somática em Araucaria angustifolia.
Título em inglês
Elucidação das respostas bioquímicas mediadas por L-arginina durante o desenvolvimento de embrões somáticos de Araucaria angustifolia (Bertol.) Kuntze.
Palavras-chave em inglês
Araucaria angustifólia
Nitric oxide
Polyamines
Somatic embryogenesis
Resumo em inglês
Araucaria angustifolia is a native conifer species of Brazil. Due to its intense exploitation, the species cover only 2% of its original forest area. Biotechnological tools, like somatic embryogenesis, may improve breeding and conservation programs. The similarity between zygotic and somatic embryogenesis have been used in studies in order to optimize somatic embryo in vitro culture, as well as a better understanding regarding molecular and biochemical mechanisms underlying embryogenesis. In this context, the maintenance of redox homeostasis determine the correct embryo development. Among the biological events regulating the oxidative balance is polyamine (PA) and nitric oxide (ON) metabolism, both biochemical pathways associated with the amino acid L-arginine. Herein, we aimed to analyse the influence of L-arginine on nitric oxide, polyamines and amino acids metabolism during proliferation of embryogenic somatic masses and initial development of somatic embryos (pre-maturation) in responsive (R) and blocked (B) cell lines. We investigated: I) endogenous nitric oxide and growth dynamics in suspensions culture supplemented with 5 and 10 mM of L-arginine; II) PAs and amino acid profiles; and III) manipulation of redox balance with glutathione and buthionine sulfoximine over embryo development. Nitric oxide content was higher on blocked cell line supplemented with L-arginine (5 and 10 m M), in the responsive cell line, the control group presented the higher content of endogenous nitric oxide. After 60 days of culture on maturation phase, the treatment with 5 mM of L-arginine presented the higher number of embryos on stage I and II of development. The biochemical profiles of polyamines was marked by a higher content of putrescine and spermine on blocked cell line in the presence of L-arginine, the content of spermidine remained constant in both cell lines. Control group presented higher embryo formation during disturbances in the redox envirornment. The results obtained here provide relevant information regarding the interaction between L-arginine metabolism and somatic embryogenesis, the presente of L-arginina (5 Mm) favored the generation of embryos, a fact associated with a decrease in NO content, as well as other biochemical behaviors, such as the accumulation of polyamine putrescine and variation in amino acid content. The knowledge from the present work provides new approaches for the improvement of the artificial conditions applied in the process of somatic embryogenesis in Brazilian Pine.
 
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Data de Liberação
2023-01-13
Data de Publicação
2021-10-04
 
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