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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.87.2019.tde-11112020-100808
Documento
Autor
Nome completo
Jonathan Mackowiak da Fonseca
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2019
Orientador
Banca examinadora
Dagli, Maria Lucia Zaidan (Presidente)
Batschinski, Karen
Bydlowski, Sergio Paulo
Cogliati, Bruno
Gomes, Cristina de Oliveira Massoco Salles
Nishiya, Adriana Tomoko
Título em português
Efeitos da toxina reengenheirada de Bacillus anthracis (PA-U2-R200A + PA-L1-I210A + LF) em osteossarcoma canino: estudos in vitro
Palavras-chave em português
Apoptose
Neoplasia
Osteossarcoma
Toxina
Resumo em português
O osteossarcoma é o tipo mais comum de câncer ósseo em cães e em seres humanos. Os osteossarcomas caninos representam um modelo único para o estudo desse tipo de câncer em humanos, devido a incidência relativamente alta, semelhanças no comportamento biológico, na apresentação clínica e características moleculares. Novas terapias seletivas para tratamento de diferentes tipos de neoplasias estão sendo testadas e algumas com resultados animadores. Uma dessas possíveis terapias seletivas é a que utiliza a toxina do Bacillus anthracis modificada geneticamente para que seja citotóxica apenas em tecidos com grande expressão de metaloproteinases (MMPs) e ativadores de plasminogênio do tipo uroquinase (uPA), que estão associadas ao crescimento tumoral e metástase. O objetivo desse estudo foi analisar a resposta de uma linhagem de osteossarcoma canino (D17) e uma linhagem de osteossarcoma humano (MG63) à toxina reengenheirada do Bacillus anthracis, testando, assim, uma possibilidade terapêutica para osteossarcomas. Comparamos as duas linhagens de osteossarcoma com uma linhagem de osteoblastos caninos não neoplásicos (COBS), estabelecida por nosso grupo. Para tanto, inicialmente, avaliou-se, a capacidade de expressão de MMPs e uPA em 21 casos de osteossarcoma canino, com os quais se construiu um bloco único de Microarranjos Teciduais (Tissue Microarrays ou TMA) e nas linhagens de osteossarcoma canino utilizadas nesse trabalho. Em seguida, a toxina modificada de Bacillus anthracis (LF+PAL1/PAU2) foi aplicada nas linhagens de osteossarcomas canino D17 e humano MG63 e na linhagem COBS, nas concentrações de 5, 15, 49, 155, 494, 1571 e 5000ng/ml. A viabilidade celular foi avaliada por meio da técnica de MTT. Realizamos também a análise de ciclo celular por citometria de fluxo (FACSCalibur - Becton & Dickinson) para a identificação de apoptose ou necrose após os tratamentos com a toxina. Estudou-se, ainda, a capacidade de migração das células D17 e MG63 em ensaio de wound healing após o tratamento com a toxina. Observamos a expressão de MMP2 em 47% e uPAR em 62% dos 21 casos de osteossarcoma em TMA. Verificamos que as duas linhagens de osteossarcoma apresentaram a expressão de MMPs e uPA, possibilitando que a toxina reengenheirada do Bacillus anthracis tivesse o efeito seletivo. O teste de citotoxicidade mostrou, após 24 horas, que as duas linhagens de osteossarcoma foram sensíveis à toxina do Bacillus anthracis em diferentes concentrações (1571 e 5000ng/ml para MG63 e 5, 15, 49, 155, 494, 1571 e 5000ng/ml para D17, na fração terapêutica da toxina LF+PAL1/PAU2). Identificou-se, por citometria de fluxo, com células marcadas com iodeto de propídeo, que houve predominância de células hipodiploides, indicando que a morte celular ocorreu por apoptose. A migração das células das duas linhagens de osteossarcoma, em ensaio de wound healing, foi menor após o tratamento de 24 horas com a toxina. Por fim, observamos que as duas linhagens de osteossarcoma apresentaram, no ensaio de imunofluorescência, a expressão de β -catenina, MAPK, K-RAS, c-Myc, p53, conexina 43; quanto a Bcl-2, apenas a linhagem MG63 apresentou positividade. Como conclusão, demostrou-se que a toxina reengenheirada do Bacillus anthracis exerceu efeitos antineoplásicos em linhagens de osteossarcomas canino e humano, determinando nestas células morte por apoptose. A toxina do Bacillus anthracis apresentou também citotoxicidade para a linhagem COBS, apenas nas maiores concentrações, determinando parada no ciclo celular em G1. Concluímos dizendo que este foi um estudo pioneiro em osteossarcomas caninos e humanos, pois a toxina reengenheirada do Bacillus anthracis não havia sido testada nessas neoplasias até o presente. Essa toxina mostrou ser um potencial tratamento promissor para o osteossarcoma e possivelmente para alguns tipos de tumores sólidos que expressam metaloproteinases e uroquinases e merece mais investigação e desenvolvimento.
Título em inglês
Effects of engineered Bacillus anthracis toxin (PA-U2-R200A +PA-L1-I210A +LF) on canine osteosarcoma: in vitro studies.
Palavras-chave em inglês
Apoptosis
Neoplasm
Osteosarcoma
Toxin
Resumo em inglês
Osteosarcoma is the most common type of bone cancer in dogs and in humans. Canine osteosarcomas represent a unique model for the study of this type of cancer in humans due to relatively high incidence, similarities in biological behavior, clinical presentation and molecular characteristics. New selective therapies for treatment of different types of neoplasm are being tested and some with encouraging results. One of these possible selective therapies is the one that uses the genetically modified Bacillus anthracis toxin to be cytotoxic only in tissues with high expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and urokinase plasminogen activators (uPA), which are associated with tumor growth and metastasis. The objective of this study was to analyze the response of a canine osteosarcoma cell line (D17) and a human osteosarcoma cell line (MG63) to the modified toxin of Bacillus anthracis, thus testing a therapeutic possibility for the treatment of osteosarcomas. We compared the two strains of osteosarcoma with a cell line of non-neoplastic canine osteoblasts (COBS), established by our group. The ability of expression MMPs and uPA in 21 cases of canine osteosarcoma in a single block of Tissue Microarrays (Tissue Microarrays or TMAs) and in the canine osteosarcoma lines used in this study was evaluated. The modified Bacillus anthracis toxin (LF+PAL1/PAU2) was applied to canine osteosarcoma D17 and human osteosarcoma MG63 and COBS cell line at the concentrations of 5, 15, 49, 155, 494, 1571 and 5000ng/ml. Cell viability was assessed by the MTT technique. We also performed the cell cycle analysis by flow cytometry (FACSCalibur - Becton & Dickinson) for the identification of apoptosis or necrosis after the treatments with the toxin. The ability to migrate D17 and MG63 cells in a wound healing assay after treatment with the toxin was also studied. We observed the expression of MMP2 in 47% and uPAR in 62% of the 21 cases of osteosarcoma in TMA. We verified that the two strains of osteosarcoma presented the expression of MMPs and uPA, allowing that the reengineered toxin of B. anthracis had the selective effect. The cytotoxicity test showed, after 24 hours, that the two strains of osteosarcoma were sensitive to the B. anthracis toxin at different concentrations (1571 and 5000ng/ml for MG63 and 5, 15, 49, 155, 494, 1571 and 5000ng/ml for D17, in the therapeutic fraction of the toxin (LF+PAL1/PAU2). It was identified by flow cytometry with cells marked with propidium iodide, which had a predominance of hypodiploid cells, indicating that cell death occurred by apoptosis. Migration of the cells from the two osteosarcoma lines in a wound healing assay was lower after the 24-hour toxin treatment. Finally, we observed that, in the immunofluorescence assay, the two strains of osteosarcoma presented the expression of β -catenin, MAPK, K-RAS, c-Myc, p53, connexin 43; as for Bcl-2, only the MG63 line showed positivity. In conclusion, the modified B. anthracis toxin has been shown to have anticancer effects in canine and human osteosarcoma strains, killing apoptosis in these cells. The B. anthracis toxin also showed cytotoxicity to the COBS lineage, only at the highest concentrations, determining cell cycle arrest at G1. We conclude by saying that this was a pioneering study in canine and human osteosarcomas, because the re-invented toxin of B. anthracis had not been tested in these neoplasms until the present. This toxin has been shown to be a potentially promising treatment for osteosarcoma and possibly for some types of solid tumors that express metalloproteinases and urokinase and deserves more research and development.
 
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Data de Publicação
2021-01-18
 
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