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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.87.2014.tde-10122014-143544
Documento
Autor
Nome completo
Dalton Giovanni Nogueira da Silva
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2014
Orientador
Banca examinadora
Mendonça, Ronaldo Zucatelli (Presidente)
Batista, Isabel de Fatima Correia
Battesti, Darci Moraes Barros
Magalhães, Geraldo Santana
Oliveira, Maria Isabel de
Título em português
Clonagem e expressão de proteína antiviral presente na hemolinfa de Lonomia obliqua por tecnologia de DNA recombinante em Escherichia coli.
Palavras-chave em português
Escherichia coli
Lonomia obliqua
Clonagem
Expressão
Proteína antiviral
Resumo em português
Em 2009, foi demonstrado um potente antiviral na hemolinfa de L. obliqua. Esta proteína purificada reduziu o título viral (TCID50 ml-1) do sarampo, pólio e H1N1 em 157, 61 e 64 vezes. Recentemente, expressamos a proteína antiviral em sistema baculovírus, que reduziu o título de vírus do herpes em 106 vezes, da rubéola e EMC em 105 vezes. No entanto, este sistema de expressão é muito caro e trabalhoso. Com isso, clonamos e expressamos esta proteína com atividade antiviral em sistema bacteriano. A sequência antiviral foi clonada em vetor de expressão pET28a. As construções resultantes foram expressas em E. coli Bl21 DE3 pLysS induzidas com IPTG 1,0 mM. Após expressão, o pellet bacteriano foi sonicado e o material foi purificado por afinidade e gel filtração. Testou-se contra o vírus EMC mostrando uma proteção de 104 vezes em relação ao controle. E utilizando qPCR para determinar os níveis de transcrição de RNA do vírus do herpes e da rubéola em células infectadas mostrou uma inibição respectivamente de 106 e 105 vezes, em relação ao controle.
Título em inglês
Cloning and expression of the antiviral protein present in the hemolymph of Lonomia obliqua by recombinant DNA technology in Escherichia coli.
Palavras-chave em inglês
Escherichia coli
Lonomia obliqua
Antiviral protein
Cloning
Expression
Resumo em inglês
In 2009, we demonstrated a potent antiviral in the hemolymph of L. obliqua. This purified protein has reduced the viral titer (TCID50 ml-1), measles and polio H1N1 157, 61 and 64 times. Recently, the antiviral protein expressed in baculovirus system, which reduced the title of the herpes virus in 106 times, rubella and EMC in 105 times. However, this expression system is very expensive and laborious. Thus, cloned and expressed this protein with antiviral activity in bacterial system. The antiviral sequence was cloned into pET28a expression vector. The resulting constructs were expressed in E. coli BL21 DE3 pLysS cells induced with 1.0 mM IPTG. Following expression, the bacterial pellet was sonicated and the material was purified by affinity and gel filtration. Was tested against EMC virus showing a protection of 104 times compared to the control. And using qPCR to determine the levels of viral RNA transcription of the herpes virus and rubella-infected cells showed an inhibition of respectively 106 and 105 times compared to the control.
 
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Data de Liberação
2018-12-09
Data de Publicação
2014-12-11
 
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