O melanoma maligno é uma forma de câncer com alto índice de morte devido, em parte, à falta de tratamentos eficazes e à sua tendência de formar metástases. Nosso grupo tem desenvolvido vetores virais para a transferência gênica de fatores anti-tumorais e, inicialmente, foi construído um vetor adenoviral, AdPG, no qual a expressão do transgene é controlada por p53, um supressor de tumor e fator de transcrição. Sendo que aproximadamente 90% dos casos de melanoma retêm p53 selvagem, foi proposto que isto pudesse ser utilizado como uma ferramenta para dirigir a expressão do transgene codificado pelo vetor AdPG, um mecanismo apoiado por resultados anteriores de nosso grupo. Por exemplo, a transdução de células B16 (melanoma de camundongo, p53-selvagem, deleção de p19^Arf) com vetores AdPG portadores de p19^Arf ou interferon-b (IFNb) resultou em morte celular maciça enquanto a transferência de apenas um destes fatores isolados não causou o mesmo efeito. O trabalho descrito aqui inclui dois avanços tecnológicos críticos em comparação com trabalhos anteriores do grupo. Primeiramente, os transgenes de interesse (eGFP, p19^Arf e IFNb) foram inseridos num vetor adenoviral que apresenta o tripetídeo RGD na sua proteína fibra. Essa modificação no vetor permite a eficiente transdução de um amplo espectro de células alvos sem a dependência do receptor viral do adenovírus selvagem, CAR. Além disso, foi construído um vetor bicistrônico, que contém a combinação de ambos os genes terapêuticos, como forma de garantir a transferência dos dois fatores ao mesmo tempo para as células-alvo. A inclusão de p19^Arf, um supressor de tumor e inibidor de MDM2, como um gene terapêutico deve complementar as atividades do p53 celular endógeno e, como consequência, atuar na promoção da expressão a partir do vetor e também na inibição da proliferação das células tumorais. Porém, a transferência de p19^Arf sozinho acarretaria efeito somente nas células que foram transduzidas e, então, seu efeito seria limitado. Por este motivo, descreve-se, além do p19^Arf, a utilização de IFNb, uma proteína secretada com funções anti-tumorais, incluindo inibição de angiogênese, indução de apoptose e ativação da resposta imunológica. A estratégia do projeto contemplou vários níveis relacionados ao mecanismo do processo de transferência, incluindo a eficiência da transdução, o mecanismo de controle da expressão dos transgenes e as atividades dos transgenes. Assim, foi proposto que a combinação de p19^Arf e IFNb pudesse ser uma estratégia interessante para induzir morte no tumor primário e uma resposta imunológica contra as células metastáticas. Com este projeto, foi iniciada a construção destes novos vetores aprimorados para transferência gênica nas células de melanoma.

Malignant melanoma is a type of cancer with high death rates, in part, because of a lack of efficient treatments and its tendency to generate metastases. Our group has developed viral vectors for the gene transfer of anticancer factors and, initially, we constructed an adenoviral vector, AdPG, in which transgene expression is controlled by p53, a tumor suppressor and transcription factor. As 90% of melanoma cases maintain wild-type p53, it was proposed that this could be used as a tool to drive transgene expression encoded by the AdPG vector, as evidenced by previous studies from our group. For example, transduction of B16 cells (mouse melanoma, wild-type p53, p19^Arf-null) with vectors encoding p19^Arf or interferon-b (IFNb) resulted in massive death cell, while transfer of just one of these factors alone did not cause the same effect. The work described here includes two critical technologic advances in comparison with our previous work. First, transgenes of interest (eGFP, p19^Arf and IFNb) were inserted into an adenoviral vector which presents the RGD tripeptide in its fiber. This vector modification allows efficient transduction in a wide range of target cells without dependence on the wild type adenovirus receptor, CAR. In addition, a bicistronic vector was constructed which contains the combination of both therapeutic genes, ensuring the transfer of both factors to the target cells at the same time. Use of p19^Arf, a tumor suppressor and MDM2 inhibitor, as a therapeutic gene should complement endogenous p53 activities and, as a consequence, promote expression from the AdPG vector and inhibit tumor cell proliferation. However, p19^Arf gene transfer alone should have an effect only in transduced cells and, therefore, its effect would be limited. For this reason, we describe, in addition to p19^Arf, the application IFNb, a secreted protein with antitumor functions, including inhibition of angiogenesis, induction of apoptosis and activation of immunologic response. This strategy involves several mechanistic levels related with the gene transfer process, including transduction efficiency, control over transgene expression and transgene activity. Therefore, it was proposed that the combination of p19^Arf and IFNb could be an interesting strategy to induce primary tumor death and an immunologic response against metastatic cells. In this project, the construction of new vectors optimized for gene transfer in melanoma cells was initiated.