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Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.87.2011.tde-10022012-112607
Documento
Autor
Nome completo
Christiane Yumi Ozaki
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2011
Orientador
Banca examinadora
Piazza, Roxane Maria Fontes (Presidente)
Maranhão, Andrea Queiroz
Tsuruta, Lilian Rumi
Título em português
Clonagem e expressão de um fragmento variável em cadeia única contra a toxina termo-lábil de Escherichia coli enterotoxigênica.
Palavras-chave em português
Escherichia coli
Immunoblotting
Anticorpos recombinantes
Clonagem
Expressão gênica
Hibridomas
Resumo em português
O diagnóstico da infecção por ETEC é baseada na detecção dos seus principais fatores de virulência, as toxinas termo-lábil e termo-estável, através de métodos de biologia molecular ou imunossorológicos. A tecnologia de anticorpos recombinantes permite a obtenção de moléculas com baixo custo, afinidades e especificidades desejáveis, através da clonagem dos domínios variáveis das cadeias leve e pesada da imunoglobulina, fusionados a um ligante flexível que permite a correta interação entre os domínios e a preservação do sítio de ligação ao antígeno. Este estudo teve como objetivo a construção de um fragmento variável em cadeia única (scFv), a partir de hibridomas produtores de anticorpo monoclonal anti-LT, seguida da sua produção em células bacterianas. Um fragmento variável em cadeia única com 723 pb foi obtido, sendo expresso em cepa de Escherichia coli como uma proteína com peso molecular aparente de 30 kDa. Após purificação em cromatografia de afinidade a Ni2+ e renaturação, o scFvLT foi capaz de reconhecer a toxina LT por ELISA de captura e Immunodot, porém não foi capaz de reconhecer as subunidades da toxina LT, por Immunoblotting, nem de neutralizar sua atividade citopática em células adrenais Y1.
Título em inglês
Cloning and expression of a single-chain fragment variable against heat-labile toxin of enterotoxigenic Escherichia coli.
Palavras-chave em inglês
Escherichia coli
Cloning
Gene expression
Hybridomas
Immunoblotting
Recombinant antibodies
Resumo em inglês
Heat-labile (LT) and heat-stable (ST) toxins are the main ETEC's virulence factors and infection diagnosis is based on their detection by molecular biology or immunoserological methods. The advances on antibody biotechnology provide alternatives to obtain low cost antibodies with desirable affinities and specificities by cloning immunoglobulin's heavy and light variable domains (HV and LV) as a single-chain fusion interspaced by a flexible linker, which allowing the correct interaction between the domains and preserving the antigen-binding site. In this study we aimed the construction of a scFv upon hybridoma cells that produce an anti-LT monoclonal antibody following its bacterial production. A single-chain fragment variable with 723 bp was obtained and expressed as a protein with apparent molecular weight of 30 kDa in Escherichia coli strain. The scFvLT recombinant antibody was submitted to metal affinity chromatography and refolding and was tested by immunoenzimatic assays. Refolded scFvLT was able to recognized LT toxin by capture ELISA and Immunodot. However, scFvLT wasnt able to recognize LT toxin subunits by Immunoblotting neither neutralize its activity in Y1 adrenal cells.
 
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Data de Publicação
2012-03-01
 
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