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Disertación de Maestría
DOI
https://doi.org/10.11606/D.87.2019.tde-05012021-135737
Documento
Autor
Nombre completo
Mariel Dourado Alcorte
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2019
Director
Tribunal
Demasi, Marcos Angelo Almeida (Presidente)
Moraes, Angela Maria
Ramos, Carlos Henrique Inacio
Soares, Carlos Roberto Jorge
Título en portugués
Produção em escala laboratorial e caracterização de variantes do colágeno tipo VII humano recombinante resistentes à clivagem por metaloproteinases de matriz
Palabras clave en portugués
Colágeno
Colágeno VII recombinante
Epidermólise bolhosa distrófica recessiva
Proteínas recombinantes
Variantes do rCOL7A1
Resumen en portugués
A Epidermólise Bolhosa Distrófica Recessiva (EBDR) é um distúrbio mecanobolhoso da pele causado por mutações no gene COL7A1, que codifica a proteína de colágeno VII (COL7A1). O fenótipo desta doença rara é caracterizado pelo aparecimento de bolhas, pela fragilidade da pele associada a pequenos traumas ou trações nos tecidos afetados, e por um processo de cicatrização de feridas incessante e mutilante. Atualmente, a EBDR não tem cura, sendo o tratamento apenas paliativo, principalmente das bolhas e infecções cutâneas. O COL7A1 é uma glicoproteína de 2.944 aminoácidos encontrada principalmente na membrana basal, sendo o componente majoritário das fibrilas de ancoragem, que são estruturas responsáveis pela promoção da aderência da derme à epiderme. Algumas opções de tratamentos para a EBDR estão sendo exploradas, dentre elas a terapia de reposição empregando o COL7A1 humano recombinante (rCOL7A1). Estudos utilizando camundongos nocaute para o gene Col7a1 demostraram que a aplicação tópica, injeções intradérmicas, e administração intravenosa de rCOL7A1 proporcionaram a reconstituição das fibrilas de ancoragem, e uma reversão parcial do fenótipo da EBDR. Trabalhos científicos indicam que o tempo de meia-vida do COL7A1 é de aproximadamente um mês, sugerindo uma frequência mensal de administração do rCOL7A1. A degradação do COL7A1 ocorre pela atuação das metaloproteinases de matriz 1 (MMP-1) e 2 (MMP-2), que, quando inibidas, favorecem a formação de fibrilas de ancoragem, sugerindo que a introdução de uma alteração dos sítios de clivagem do COL7A1 pelas MMP-1 ou MMP-2 proporcionaria um aumento do tempo de meia-vida das fibrilas de ancoragem. O presente trabalho de mestrado busca contribuir para a obtenção de uma opção terapêutica inédita para a EBDR, tendo como objetivo a obtenção de formas variantes de rCOL7A1 possivelmente resistentes à ação proteolítica das MMP-1 e MMP-2. Os objetivos específicos envolveram a produção em escala laboratorial, bem como a avaliação bioquímica e estrutural, de três formas variantes de rCOL7A1, putativamente resistentes à MMP-2 (COL7A1V1), à MMP-1 (COL7A1V2), e às MMP-1 e MMP-2 (COL7A1V3). Células CHO-DG44 foram transfectadas estavelmente com os vetores de expressão das formas selvagem e variantes do rCOL7A1, e submetidas ao processo de indução da amplificação gênica. Foram obtidas as linhagens celulares produzindo estavelmente o rCOL7A1 selvagem e os variantes COL7A1V1, COL7A1V2 e COL7A1V3. As proteínas produzidas foram caracterizadas por Western blot demonstrando a integridade estrutural da forma monomérica e a capacidade de formação da forma trimérica in vitro. Os resultados obtidos constituem os primeiros passos para a caracterização bioquímica mais detalhada das formas variantes de rCOL7A1 potencialmente resistentes à degradação mediada pelas MMP1 e MMP2.
Título en inglés
Laboratory scale production and characterization of variants of recombinant human type VII collagen resistant to matrix metalloproteinases cleavage.
Palabras clave en inglés
Collagen VII
Recessive dystrophic epidermolysis bullosa
Recombinant collagen
Recombinant protein
Variants forms of rCOL7A1
Resumen en inglés
Recessive Dystrophic epidermolysis bullosa (RDEB) is a mechanobullous skin disorder caused by mutations in the COL7A1 gene encoding the protein collagen VII (COL7A1). The phenotype of this rare inherited disease is characterized by blistering and skin fragility associated with minor trauma or friction in affected tissues and by an unceasing and mutilating wound healing process. Currently, RDEB has no cure, and treatment is only palliative, aiming especially at dealing with blistering and skin infections. COL7A1 is a glycoprotein of 2,944 amino acids found mainly in the basement membrane, being the major component of the anchoring fibrils, responsible for the attachment between the dermis and the epidermis. Some alternative treatment options are being explored, including replacement therapy with human recombinant COL7A1 (rCOL7A1). Studies employing knockout mice for the Col7a1 gene demonstrated that the topical, intradermal injections and intravenous administration of rCOL7A1 enabled the reconstitution of anchoring fibrils, and a partial phenotypic reversal of RDEB phenotype. Scientific works disclose the COL7A1 half-life as approximately one month, suggesting that the administration frequency of rCOL7A1 would be once a month. The degradation of COL7A1 occurs through the action of matrix metalloproteinases 1 (MMP-1) and 2 (MMP-2), which, when inhibited, facilitate the formation of anchoring fibrils, suggesting that changing the COL7A1s MMP-1 or MMP-2 cleavage sites would increase the half-life of the anchoring fibrils. This project aims at contributing to the establishment of a novel therapeutic option for RDEB having as the main Objective the obtaining of rCOL7A1 variants forms possibly resistant to proteolysis mediated by MMP-1 and MMP-2. The specific Objectives involved the laboratory scale production, as well as the biochemical and structure evaluation, of three rCOL7A1 variants putatively resistant to the action of metalloproteinases MMP-2 (COL7A1V1), MMP-1 (COL7A1V2), and both MMP-1 and MMP-2 (COL7A1V3). The CHO-DG44 cells were stably transfected with the expression vectors of the wild-type and variant forms of rCOL7A1 and submitted to the induction of the gene amplification process. We obtained cell lines stably producing rCOL7A1 and its variants COL7A1V1, COL7A1V2 and COL7A1V3. The proteins were characterized by Western blot demonstrating monomer structural integrity and ability to form rCOL7A1 homotrimer in vitro. The results obtained constitute the first steps for the more detailed biochemical characterization of rCOL7A1 variants potentially resistant to MMP1- and MMP2-induced degradation.
 
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Fecha de Liberación
2023-01-05
Fecha de Publicación
2021-10-13
 
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