Doenças pneumocócicas são a principal causa de óbitos entre crianças menores de 5 anos em todo o mundo. Dado o crescente número de cepas de Streptococcus pneumoniae resistentes a antibióticos, a vacinação é a forma mais eficiente de prevenir doenças causadas por esta bactéria. Embora existam várias vacinas pneumocócicas no mercado, todas são baseadas no polissacarídeo capsular do pneumococo. Estas vacinas têm cobertura limitada, já que é inviável incluir os polissacarídeos dos mais de 90 sorotipos diferentes de S. pneumoniae, e promovem a substituição de sorotipos na população por aqueles não cobertos pela vacina. Uma alternativa que contornaria este problema seria a produção de vacinas baseadas em antígenos conservados entre todos os sorotipos. Destes, proteínas de S. pneumoniae têm se mostrado candidatas promissoras. O objetivo deste trabalho é produzir e avaliar in vitro e in vivo uma vacina pneumocócica composta por proteínas de S. pneumoniae carregadas em nanopartículas poliméricas visando a imunização pela via pulmonar. As proteínas escolhidas foram a pneumolisina geneticamente detoxificada (PdT), e um fragmento da proteína A de superfície do pneumococo do clado 4 (PspA4Pro). O gene da PdT foi expresso em Escherichia coli e a proteína produzida foi reconhecidas por anticorpos produzidos contra a célula inteira de pneumococo via western blot. Estoques produtores de PdT foram preparados para experimentos futuros. A PspA4Pro foi purificada através da lise da biomassa em homogeneizador de alta pressão, precipitação de contaminantes com detergente catiônico, cromatografias de troca iônica e crioprecipitação em pH ácido. Ferramenta de planejamento experimental foi utilizada para otimizar a etapa de precipitação com detergente. A PspA4Pro foi inserida em nanopartículas de poli-(glicerol adipato-co--pentadecalactona) (PGA-co-PDL) ou de polímero X produzidas com ou sem diferentes tipos de quitosana. Estas nanopartículas foram encapsuladas em micropartículas de L-leucina pela técnica de spray dry. As nanopartículas produzidas apresentaram tamanho menor do que 200 nm, ideal para a internalização por células dendríticas, baixa polidispersão e baixa toxicidade. As proteínas liberadas das nanopartículas mantiveram sua integridade, a capacidade de ligar à lactoferrina humana e foram reconhecidas por anticorpos anti-PspA. O ensaio de aerolização das micropartículas mostraram que estas são capazes de chegar às vias aéreas inferiores de humanos e ensaios in vitro mostraram que as micropartículas foram capazes de ativar células dendríticas extraídas da medula óssea de camundongos. Camundongos imunizados por via pulmonar com duas doses das micropartículas produziram mais IgG anti-PspA do que animais imunizados via subcutânea ou via pulmonar com PspA4Pro e tiveram taxas de sobrevivência mais alta quando desafiados com S. pneumoniae. Tanto as nanopartículas de PGA-co-PDL quanto as de X se mostraram promissoras para serem utilizadas como veículos para vacinas pneumocócicas dado seu potencial adjuvante e por permitirem o transporte a seco das proteínas sem degradação e mantendo sua imunogenicidade.

Pneumococcal diseases are the leading cause of death among children under 5 years of age worldwide. Given the growing number of antibiotic resistant Streptococcus pneumoniae strains, vaccination is the most efficient way to prevent diseases caused by this bacterium. Although there are several pneumococcal vaccines on the market, they are all based on the pneumococcal capsular polysaccharide. These vaccines have limited coverage since it is unfeasible to include the polysaccharides from more than 90 different S. pneumoniae serotypes, and promote the replacement of serotypes in the population by those not covered by the vaccine. An alternative that would circumvent this problem would be the production of vaccines with antigens conserved among all serotypes. Of these, S. pneumoniae proteins have been shown to be promising candidates. The objective of this work is to produce and evaluate in vitro and in vivo a pneumococcal vaccine composed of proteins of S. pneumoniae loaded in polymeric nanoparticles aiming the immunization by the pulmonary route. The proteins chosen were genetically detoxified pneumolysin (PdT), and a fragment of pneumococcal surface protein A from clade 4 (PspA4Pro). The PdT gene was expressed in Escherichia coli and the proteins produced were recognized by antibodies raised against the whole pneumococcal cell via western blot. PdT-producing stocks were prepared for future experiments. PspA4Pro was purified by lysing the biomass in a high pressure homogenizer, precipitating contaminants with cationic detergent, ion exchange chromatography and cryoprecipitation at acidic pH. The experimental planning tool was used to optimize the detergent precipitation step. PspA4Pro was inserted into poly(glycerol adipate-co--pentadecalactone) (PGA-co-PDL) or polymer X nanoparticles produced with or without different types of chitosan. These nanoparticles were encapsulated in L-leucine microparticles by spray dry technique. The nanoparticles produced were smaller than 200 nm, ideal for dendritic cell internalization, with low polydispersity and low toxicity. The proteins released from the nanoparticles maintained their integrity, the ability to bind to human lactoferrin and were recognized by anti-PspA antibodies. The microparticle aerolisation assay showed that they are able to reach the lower airways of humans and in vitro assays have shown that the microparticles were able to activate dendritic cells extracted from the mouse marrow. Mice immunized via the pulmonary route with two doses of the microparticles produced more anti-PspA IgG than animals immunized via subcutaneous or pulmonary routes with PspA4Pro and had higher survival rates when challenged with S. pneumoniae. Both PGA-co-PDL and X nanoparticles have shown promise for use as carriers for pneumococcal vaccines given their adjuvant potential and for allowing dry transport of the proteins without degradation and maintaining their immunogenicity.