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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.85.2021.tde-22102021-122216
Documento
Autor
Nome completo
Luiz Felipe Teixeira da Silva
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2021
Orientador
Banca examinadora
Marumo, Maria Helena Bellini (Presidente)
Ferreira, Rafael Vicente de Padua
Sousa, Eliza Higuti
Título em português
Avaliação da capacidade angiogênica da linhagem celular de adenocarcinoma renal humano knockout para a proteína NF-kB1
Palavras-chave em português
carcionoma renal de células claras (CCR)
CRISPR/Cas9
gene endógeno
hipóxia
NF-kB1
Resumo em português
O carcinoma de células renais (CCR) é o câncer epitelial renal adulto mais comum, sendo responsável por mais de 90% de todas as neoplasias renais. O subtipo mais frequente de CCR é o de células claras (CCRcc). A maioria dos pacientes com CCRcc possui mutação no gene supressor tumoral de Von Hippel-Lindau (VHL). O gene VHL codifica uma proteína, a VHL, que é capaz de regular negativamente uma série de proteínas intracelulares, dentre elas o fator induzível por hipóxia (HIF). Muitas moléculas têm sido apontadas como responsáveis pelo fenótipo agressivo desse tumor, uma delas é o fator de transcrição NF-kB, que é o nome coletivo para os fatores de transcrição da família Rel. Em mamíferos são conhecidos cinco membros desta família: RelA (p65), RelB, c-Rel, NF-kB1 (p105/p50) e o NF-kB2 (p100/p52). No CCR, o aumento da atividade do NF-kB correlacionava-se com o aumento de marcadores de angiogênese tais como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e Interleucina 6 (IL-6). Nos últimos anos vários grupos têm demonstrado o papel funcional do NF-kB1 na tumorigenicidade do CCR. Nesse projeto utilizamos a técnica CRISPR/Cas-9 para obtenção de uma linhagem celular de adenocarcinoma renal humano knockout para a proteína NF-kB1. Foi realizada a verificação do gene endógeno mais estável para condições de normóxia e hipóxia. Foi feita a quantificação dos níveis de VEGF e IL-6 em condição de normóxia e hipóxia. A técnica CRISPR/Cas9 foi eficaz para obtenção de células 786-0 nocaute para NF-kB1 (p105/p50). Dentre os oito genes endógenos analisados, o TRFC foi o mais estável e, consequentemente, o mais adequado para estudos com as células 786-0 em hipóxia. A supressão da expressão da p50 nos clones 786-0 sg1, 786-0 sg2 e 786-0 sg3 resultou na redução de VEGF e IL6 tanto em normóxia quando em hipóxia. A redução do diferencial hipóxia/normóxia demonstra uma alteração na responsividade celular à hipóxia no que diz respeito à Il-6. A redução dos níveis de IL-6, pode justificar a redução da MMP-9 e migração celular observados por nosso grupo.
Título em inglês
Evaluation of angiogenic capacity of human adenocarcinoma cell line knockout for NF-kB1 protein
Palavras-chave em inglês
clear cell renal carcinoma (RCC)
CRISPR/Cas9
housekeep gene
hypoxia
NF-kB1
Resumo em inglês
Renal cell carcinoma (RCC) is the most common adult renal epithelial cancer, accounting for more than 90% of all renal neoplasms. The most frequent subtype of RCC is clear cell (ccRCC). Most patients with ccRCC have a mutation in the Von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene. The VHL gene encodes a protein, the VHL, which can down-regulate a series of intracellular proteins, including the hypoxia-inducible factor (HIF). Many molecules have been identified as responsible for the aggressive phenotype of this tumor, one of them is the transcription factor NF-kB, which is the collective name for the transcription factors of the Rel family. In mammals, five members of this family are known: RelA (p65), RelB, c-Rel, NF-kB1 (p105/p50) and NF-kB2 (p100/p52). In RCC, the increase in NF-kB activity was correlated with the increase in angiogenesis markers such as vascular endothelial growth factor (VEGF) and Interleukin 6 (IL-6). In recent years, several groups have demonstrated the functional role of NF-kB1 in RCC tumorigenicity. In this project, we used the CRISPR/Cas-9 technique to obtain a human renal adenocarcinoma cell line knockout for the NF-kB1 protein. Verification of the most stable endogenous gene for conditions of normoxia and hypoxia was carried out. The quantification of VEGF and IL-6 levels was carried out under conditions of normoxia and hypoxia. The CRISPR/Cas9 technique was effective to obtain 786-0 knockout cells for NF-kB1 (p105/p50). Among the eight endogenous genes analyzed, TRFC was the most stable and, consequently, the most suitable for studies with 786-0 cells in hypoxia. Suppression of p50 expression in clones 786-0 sg1, 786-0 sg2 and 786-0 sg3 resulted in reduction of VEGF and IL6 in both normoxia and hypoxia. The reduction in the hypoxia/normoxia differential demonstrates a change in cellular responsiveness to hypoxia with respect to IL-6.
 
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Data de Publicação
2021-10-27
 
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