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Disertación de Maestría
DOI
10.11606/D.85.2009.tde-22092011-101810
Documento
Autor
Nombre completo
Larissa Miranda Pereira
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2009
Director
Tribunal
Affonso, Regina (Presidente)
Dias, Ligia Ely Morganti Ferreira
Silva, Ismael Dale Cotrim Guerreiro da
Título en portugués
Clonagem, expressão, purificação e caracterização estrutural da proteína ribossomal L10 humana recombinante
Palabras clave en portugués
proteína ribossomal L10
proteína supressora de tumor
QM
Resumen en portugués
A proteína ribossomal L10 (RP L10) é uma forte candidata a ser incluída na classe de proteínas supressoras de tumor. Também denominada QM, a proteína em questão é conhecida por participar da ligação das subunidades ribossomais 60S e 40S e da tradução de mRNAs. Possui massa molecular entre 24 a 26 kDa e ponto isoelétrico (pI) 10,5. A seqüência da proteína QM é bastante conservada em mamíferos, plantas, invertebrados, insetos e leveduras indicando que esta possui funções críticas na célula. Com função supressora de tumor, a proteína RP L10 foi estudada em linhagens de tumor de Wilm (WT-1) e em células tumorais de estômago, nas quais se observou uma diminuição na quantidade de seu mRNA. Mais recentemente a RP L10 foi encontrada em baixas quantidades nos estágios iniciais de adenoma de próstata e com uma mutação em câncer de ovário, indicando uma participação no desenvolvimento destas doenças. Como proteína, já foi descrito que esta interage com as proteínas c-Jun e c-Yes, inibindo a ação ativadora de fatores de crescimento e divisão celular. Este trabalho tem um papel importante no estabelecimento da expressão desta proteína solúvel, para estudos posteriores que tenham como objetivo avaliar a ação de regiões específicas que atuam na ligação das subunidades ribossomais 60S e 40S e tradução, bem como nas regiões que se ligam a proto-oncogenes. O cDNA para proteína QM foi amplificado por PCR e clonado no vetor de expressão periplásmica p3SN8. A proteína QM foi expressa em E.coli BL21 (DE3) no citoplasma e periplasma bacteriano e na melhor condição, a expressão de QM de bactérias transformadas pelo plasmídeo recombinante p1813_QM em 25°C ou 30°C, a proteína foi obtida solúvel e com quantidad es muito pequenas de contaminantes. Os ensaios de estrutura secundária demonstraram que a proteína QM tem predominância de a-hélice, mas quando do seu desenovelmento, essa condição muda e a proteína passa a ter característica de folhas β.
Título en inglés
Cloning, periplasmic expression, purification and structural characterization of human ribosomal protein L10 recombinant
Palabras clave en inglés
QM
ribosomal protein L10
tumor suppressor proteins
Resumen en inglés
The ribosomal protein L10 (RP L10) is a strong candidate to be included in the class of tumor suppressor proteins. This protein, also denominated as QM, is known to participate in the binding of ribosomal subunits 60S and 40S and the translation of mRNAs. It has a molecular weight that varies between 24 and 26 kDa and an isoelectric point of (pI) 10.5. The sequence of the protein QM is highly conserved in mammals, plants, invertebrates, insects and yeast which indicates its critical functions in a cell. As a tumor suppressor, RP L10 has been studied in strains of Wilm's tumor (WT-1) and tumor cells in the stomach, where was observed a decrease in the amount of its mRNA. More recently, the RP L10 was found in low amounts in the early stages of prostate adenoma and showed some mutation in ovarian cancer, what indicates its role as a suppressor protein in the development of these diseases. It has also been described that this protein interacts with c-Jun and c-Yes inhibiting growth factors and consequently, cell division. This work has an important role on the establishment of soluble expression of QM to give base information for further studies on expression that aim to evaluate the specific regions where it acts binding the 60S and 40S ribossomal subunits and translation, as well as its binding to proto-oncogenes. The cDNA for QM protein was amplified by PCR and cloned into periplasmic expression vector p3SN8. The QM protein was expressed in E. coli BL21 (DE3) in the region of cytoplasm and periplasm, the best condition was obtained from the expression of the recombinant plasmid QM p1813_QM at 25°C or 30°C, the soluble protein was obtained with small amounts of contaminants. The assays of secondary structure showed that the QM protein is predominantly alpha-helix, but when it loses the folding, this condition changes and the protein is replaced by β- sheet feature.
 
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2009PereiraClonagem.pdf (957.75 Kbytes)
Fecha de Publicación
2011-10-17
 
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