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Dissertação de Mestrado
DOI
Documento
Autor
Nome completo
Kleicy Cavalcante Amaral
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2019
Orientador
Banca examinadora
Vieira, Daniel Perez (Presidente)
Guimarães, Luciana Maria
Magalhães, Geraldo Santana
Título em português
Expressão, purificação e caracterização físico-química da rhBMP-2 (recombinante humana BMP-2)
Palavras-chave em português
Escherichia coli
proteína recombinante
rhBMP-2
Resumo em português
As proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) são um grupo proteico pertencente à superfamília dos fatores transformadores de crescimento beta (TGF-β). Dentre estas, a BMP-2 humana recombinante (rhBMP-2) tem sido amplamente estudada, devido suas propriedades osteoindutoras. Já existe a comercialização desta proteína produzida por tecnologia de DNA recombinante em células de ovário de hamster chinês (CHO) e para fins de pesquisa, a expressa no citoplasma de bactérias Escherichia coli (E. coli). A rhBMP-2 na sua forma homodimérica possui alta atividade biológica, induzindo a mineralização óssea em ossos endocondrais e a diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos e osteoclastos. O objetivo desse trabalho consistiu em obter a rhBMP-2 através da produção em bactérias E. coli, altamente purificada através de técnicas cromatográficas e com atividade biológica. As cepas utilizadas para produção foram a W3110 e a BL21(DE), transformadas com plasmídeos contendo o cDNA da hBMP-2 cultivadas em três temperaturas de expressão: 25 °C, 37 °C e 42 °C. Para purificação dessa proteína foram utilizadas duas técnicas cromatográficas: afinidade a heparina e exclusão molecular por cromatografia líquida de alto desempenho (HPSEC). As coletas destas etapas de purificação levaram a separação de oito produtos que foram caracterizados por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western Blotting (WB). A atividade biológica foi averiguada por produção de fosfatase alcalina em células mioblásticas de camundongo (C2C12). A avaliação dos produtos comerciais também foi feita através dessas técnicas. Os resultados indicaram que dois dos oito produtos purificados, um obtido a partir da produção na cepa BL21(DE) à 25 °C e outro da produção na cepa W3110 à 42 °C, apresentaram relevante grau de pureza e atividade biológica.
Título em inglês
Expression, purification and physical-chemical characterization of rhBMP-2
Palavras-chave em inglês
Escherichia coli
recombinant protein
rhBMP-2
Resumo em inglês
Bone morphogenetic proteins (BMP) belongs to the Transforming Grown Factor -β superfamily (TGF- β). Among this group, the recombinant human BMP-2 (rhBMP-2) has been widely investigated, because of its osteoinductive activity. There is already a commercial product based on recombinant DNA technology from Chinese hamster ovary (CHO) cells and also for research use, one expressed in the cytoplasm of Escherichia coli (E. coli). The rhBMP-2 in its homodimer form has high biological activity, lead to a bone mineralization in endochondral bones, and differentiate mesenchymal cells into osteoblasts and osteoclasts. The aim of this study consisted in obtaining the rhBMP-2 by producing in E. coli, highly purified through chromatographic techniques and with biological activity. The bacteria strains used for production were W3110 and BL21(DE), cultivated in three different expression temperatures 25 °C, 37 °C e 42 °C. Two chromatographic techniques were used for the purification of this protein from periplasmic fluid: heparin affinity and High Performance Size Exclusion Chromatography (HPSEC). The fractions collected from these purification steps led to separation of eight products characterized by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting (WB). The biological activity analysis was checked by the induction at alkaline phosphatase production in mouse myoblast C2C12 cells. The analysis of the commercial products was also made with these techniques. The results showed that two among the eight purified products, obtained from BL21 in 25°C one and W3110 42°C one, exhibit high purity and biological activity.
 
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Data de Publicação
2019-11-07
 
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