• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Master's Dissertation
DOI
Document
Author
Full name
Kleicy Cavalcante Amaral
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2019
Supervisor
Committee
Vieira, Daniel Perez (President)
Guimarães, Luciana Maria
Magalhães, Geraldo Santana
Title in Portuguese
Expressão, purificação e caracterização físico-química da rhBMP-2 (recombinante humana BMP-2)
Keywords in Portuguese
Escherichia coli
proteína recombinante
rhBMP-2
Abstract in Portuguese
As proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) são um grupo proteico pertencente à superfamília dos fatores transformadores de crescimento beta (TGF-β). Dentre estas, a BMP-2 humana recombinante (rhBMP-2) tem sido amplamente estudada, devido suas propriedades osteoindutoras. Já existe a comercialização desta proteína produzida por tecnologia de DNA recombinante em células de ovário de hamster chinês (CHO) e para fins de pesquisa, a expressa no citoplasma de bactérias Escherichia coli (E. coli). A rhBMP-2 na sua forma homodimérica possui alta atividade biológica, induzindo a mineralização óssea em ossos endocondrais e a diferenciação de células mesenquimais em osteoblastos e osteoclastos. O objetivo desse trabalho consistiu em obter a rhBMP-2 através da produção em bactérias E. coli, altamente purificada através de técnicas cromatográficas e com atividade biológica. As cepas utilizadas para produção foram a W3110 e a BL21(DE), transformadas com plasmídeos contendo o cDNA da hBMP-2 cultivadas em três temperaturas de expressão: 25 °C, 37 °C e 42 °C. Para purificação dessa proteína foram utilizadas duas técnicas cromatográficas: afinidade a heparina e exclusão molecular por cromatografia líquida de alto desempenho (HPSEC). As coletas destas etapas de purificação levaram a separação de oito produtos que foram caracterizados por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western Blotting (WB). A atividade biológica foi averiguada por produção de fosfatase alcalina em células mioblásticas de camundongo (C2C12). A avaliação dos produtos comerciais também foi feita através dessas técnicas. Os resultados indicaram que dois dos oito produtos purificados, um obtido a partir da produção na cepa BL21(DE) à 25 °C e outro da produção na cepa W3110 à 42 °C, apresentaram relevante grau de pureza e atividade biológica.
Title in English
Expression, purification and physical-chemical characterization of rhBMP-2
Keywords in English
Escherichia coli
recombinant protein
rhBMP-2
Abstract in English
Bone morphogenetic proteins (BMP) belongs to the Transforming Grown Factor -β superfamily (TGF- β). Among this group, the recombinant human BMP-2 (rhBMP-2) has been widely investigated, because of its osteoinductive activity. There is already a commercial product based on recombinant DNA technology from Chinese hamster ovary (CHO) cells and also for research use, one expressed in the cytoplasm of Escherichia coli (E. coli). The rhBMP-2 in its homodimer form has high biological activity, lead to a bone mineralization in endochondral bones, and differentiate mesenchymal cells into osteoblasts and osteoclasts. The aim of this study consisted in obtaining the rhBMP-2 by producing in E. coli, highly purified through chromatographic techniques and with biological activity. The bacteria strains used for production were W3110 and BL21(DE), cultivated in three different expression temperatures 25 °C, 37 °C e 42 °C. Two chromatographic techniques were used for the purification of this protein from periplasmic fluid: heparin affinity and High Performance Size Exclusion Chromatography (HPSEC). The fractions collected from these purification steps led to separation of eight products characterized by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting (WB). The biological activity analysis was checked by the induction at alkaline phosphatase production in mouse myoblast C2C12 cells. The analysis of the commercial products was also made with these techniques. The results showed that two among the eight purified products, obtained from BL21 in 25°C one and W3110 42°C one, exhibit high purity and biological activity.
 
WARNING - Viewing this document is conditioned on your acceptance of the following terms of use:
This document is only for private use for research and teaching activities. Reproduction for commercial use is forbidden. This rights cover the whole data about this document as well as its contents. Any uses or copies of this document in whole or in part must include the author's name.
Publishing Date
2019-11-07
 
WARNING: Learn what derived works are clicking here.
All rights of the thesis/dissertation are from the authors
CeTI-SC/STI
Digital Library of Theses and Dissertations of USP. Copyright © 2001-2021. All rights reserved.