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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.85.2020.tde-16072021-135829
Documento
Autor
Nome completo
Enio Aparecido Zacarias
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2020
Orientador
Banca examinadora
Peroni, Cibele Nunes (Presidente)
Magalhães, Geraldo Santana
Sousa, Eliza Higuti
Título em português
Comparação de eficiência entre vetores contendo a sequência genômica e complementar, acrescida ou não da região downstream, do hormônio de crescimento humano na terapia gênica
Palavras-chave em português
camundongo anão imunodeficiente
DNA complementar (cDNA)
DNA genômico (gDNA)
eletrotransferência
hormônio de crescimento humano (hGH)
terapia gênica
Resumo em português
A deficiência de hormônio de crescimento (GHD) é geralmente tratada com injeções repetidas do hormônio recombinante. Nosso grupo tem trabalhado com uma alternativa para o tratamento padrão da GHD, utilizando um modelo de terapia gênica baseado em uma única injeção de DNA plasmidial (naked DNA) contendo a sequência genômica (gDNA) do hormônio de crescimento humano (hGH). Utilizamos uma abordagem in vivo na qual o vetor de expressão é administrado em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid), seguido por eletrotransferência. Em estudos anteriores, obtivemos níveis elevados de hGH no soro desses camundongos (~ 20 ng/mL) com uma aproximação de crescimento em relação ao camundongo normal (catch-up growth) de ~ 70% para o peso corporal e de ~ 80% para o comprimento do fêmur, utilizando um vetor plasmidial contendo o gDNA do hGH com o promotor de ubiquitina-C. Por outro lado, em trabalho anterior tivemos uma indicação de que a sequência complementar (cDNA) poderia ter uma vantagem sobre o gDNA em nosso protocolo de terapia gênica. No presente trabalho, nosso objetivo foi realizar um estudo comparativo entre vetores contendo as sequências genômica (gDNA), complementar (cDNA) ou complementar acrescida da região 3' (cDNA 3') do hGH. Primeiro, os vetores foram analisados quanto aos níveis de expressão in vitro mediante transfecção de células HEK-293. Os níveis de hGH foram mensurados por ELISA e atingiram 20,96 ± 4,28 μg/mL para gDNA, 1,59 ± 0,42 μg/mL para cDNA e 3,13 ± 0,71 μg/mL para cDNA+3', após 72 h da transfecção. Uma segunda quantificação foi realizada por RP-HPLC e o padrão de expressão foi o mesmo da quantificação por ELISA. Em seguida, foram realizados bioensaios administrando esses vetores em camundongos lit/scid, via eletrotransferência, no músculo tibial anterior. O primeiro bioensaio foi de 7 dias e, ao final do experimento, os níveis de expressão de hGH foram estatisticamente diferentes somente entre os grupos gDNA/cDNA+3', sendo que o primeiro apresentou o maior nível de expressão. Quanto aos níveis de mIGF-1, não houve diferença estatística entre os grupos gDNA/cDNA+3', apenas esses dois em comparação com o cDNA e, mais uma vez, o grupo gDNA apresentando o maior nível de expressão. Foi realizado um segundo bioensaio, agora de 30 dias, no qual, além dos níveis de hGH e mIGF-1, também foram determinados os incrementos do peso corporal e do comprimento do corpo total, da cauda e dos fêmures. Ao final deste bioensaio, os níveis de expressão de hGH não apresentaram diferença estatística entre os grupos de DNA. Por outro lado, os maiores níveis de expressão de mIGF-1 foram obtidos nos grupos gDNA e cDNA+3'. Finalmente, as porcentagens de catch-up growth foram calculadas e os melhores resultados foram novamente para o gDNA, com variações de 16,6 a 32,4 % para os parâmetros avaliados. Esses resultados indicam, portanto, que o plasmídeo contendo a sequência gDNA é mais eficiente para o estímulo de expressão do IGF-1 e incremento na porcentagem de recuperação dos parâmetros analisados do que as outras sequências de DNA utilizadas. Em conclusão, os resultados alcançados neste projeto são opostos aos esperados por nós, pois acreditávamos que o cDNA poderia apresentar um maior nível de expressão quando comparado ao gDNA, em nosso modelo de terapia gênica. Pelo contrário, o gDNA apresentou os melhores resultados para hGH, mIGF-1 e catch-up growth, seguidos pelos grupos cDNA+3' e cDNA. O fato do cDNA+3' ter apresentado melhores resultados que o cDNA provavelmente é devido à região 3', a qual é conhecida por conter sequências que podem aumentar a eficiência da transcrição. Portanto, continuaremos a utilizar o vetor contendo o gDNA em nossos estudos de terapia gênica.
Título em inglês
Comparison of efficiency between vectors containing the genomic and the complementary sequences, with or without the downstream region, of the human growth hormone in gene therapy
Palavras-chave em inglês
complementary DNA (cDNA)
electrotransference
gene therapy
genomic DNA (gDNA)
human growth hormone (hGH)
immunofeficient \"little\" mice
Resumo em inglês
Growth hormone deficiency (GHD) is usually treated with repeated injections of the recombinant hormone. Our group has been working with an alternative to the standard treatment of GHD using a gene therapy model based on a single injection of plasmid DNA (naked DNA) containing the genomic sequence (gDNA) of human growth hormone (hGH). We are using an in vivo approach in which the expression vector is administered into immunodeficient dwarf (lit/scid) mice, followed by electrotransference. In previous studies, elevated levels of hGH in mice serum (~ 20 ng/mL) with an approximation of growth to normal mice (catch-up growth) of ~ 70% for body weight and of ~ 80% for femur length were obtained, using a plasmid containing the gDNA of hGH with the ubiquitin-C promoter. On the other hand, in previous work we had an indication that the complementary sequence (cDNA) could have an advantage over gDNA in our gene therapy protocol. In the present work, our objective was to carry out a comparative study of efficiency between vectors containing the genomic (gDNA), the complementary (cDNA) or the complementary sequence with the 3' region (cDNA 3') of hGH First, the vectors were analyzed for in vitro expression levels by transfecting HEK-293 cells. The levels of hGH were measured by ELISA and reached 20.96 ± 4.28 μg/mL for gDNA, 1.59 ± 0.42 μg/mL for cDNA and 3.13 ± 0.71 μg/mL for cDNA+3', after 72 hours from transfection. A second quantification was carried out by RP-HPLC and the expression pattern was maintained as in the quantification by ELISA. Then, bioassays were performed administering these vectors into lit/scid mice, via electrotransference, in the tibialis anterior muscle. The first one was a 7-day bioassay and, at the end of the experiment, the hGH expression levels were statiscally different only between gDNA/cDNA+3' groups, with the first group presenting the highest expression level. For the mIGF-1 levels, there was no statistical difference between gDNA/cDNA+3' groups, only these two compared to the cDNA and, again, the gDNA group showing the highest expression level. A second bioassay, now with 30-days duration, was carried out, in which, in addition to the levels of hGH and mIGF-1, increments of body weight and total body length, tail and femurs were also determined. At the end of this bioassay, the levels of hGH expression showed no statistical difference between the DNA groups. On the other hand, the highest levels of mIGF-1 expression were obtained in the gDNA and cDNA+3' groups Finally, the catch-up growth percentages were calculated and the best results were again for the gDNA, with a range of 16.6 to 32.4 % for the evaluated parameters. These results indicate, therefore, that the plasmid containing the gDNA sequence is more efficient for stimulating IGF-1 expression and reaches better catch-up growth percentages of the evaluated parameters than the other DNA sequences used. In conclusion, the results achieved in this project are opposite to those expected by us, as we believed that cDNA could have a higher expression level when compared to gDNA in our gene therapy model. On the contrary, gDNA showed the best results for hGH, mIGF-1 and catch-up growth, followed by cDNA+3' and cDNA. The fact that cDNA+3' had presented better results than cDNA is probably due to the 3' region, that is known to contain sequences that can increase the efficiency of transcription. Therefore, we will continue to use the vector containing the gDNA in our gene therapy studies.
 
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Data de Publicação
2021-07-20
 
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