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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.85.2021.tde-14072021-145052
Document
Author
Full name
Alissandra de Moura Gomes
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2021
Supervisor
Committee
Peroni, Cibele Nunes (President)
Faverani, Leonardo Perez
Sousa, Eliza Higuti
Title in Portuguese
Eletrotransferência do gene do hormônio de crescimento de camundongo associada à administração de células-tronco mesenquimais em modelo murino de osteogênese imperfeita
Keywords in Portuguese
camundongo oim
células-tronco mesenquimais
eletrotransfêrencia in vivo
hormônio de crescimento
osteogênese imperfeita
terapia celular
terapia gênica
Abstract in Portuguese
Ensaios pré-clínicos e clínicos de terapia gênica e terapia celular vêm sendo desenvolvidos e aplicados de forma bastante promissora, ao longo das últimas décadas, frente à procura pela cura ou pela melhora efetiva de diversas desordens genéticas. Nosso grupo de Terapia Gênica do Centro de Biotecnologia, do IPEN, possui ampla experiência na entrega in vivo de DNA plasmidial contendo os genes do hormônio de crescimento humano (hGH) e murino (mGH) para o tratamento de camundongos GH-deficientes, desenvolvendo protocolos que apresentaram resultados bastante relevantes nos últimos 10 anos. Diante disso, neste trabalho propomos uma abordagem inédita baseada na associação entre a terapia gênica in vivo e o transplante alogênico de células-tronco mesenquimais para o tratamento da osteogênese imperfeita (OI) em um modelo murino, o camundongo oim. A principal característica da OI é a fragilidade óssea causada, principalmente, pelas mutações nos genes que sintetizam ou processam o colágeno tipo I, e nos genes responsáveis pela maturação dos osteoblastos. Inicialmente, nós avaliamos duas linhagens de células-tronco mesenquimais (CTMs), extraídas de dois tecidos diferentes, medula óssea (CTM-MO) e tecido adiposo (CTM-TA), a fim de compreender quais das duas melhor exerce um papel osteo reparador sobre os fêmures de camundongos oim. Estas células foram aplicadas localmente através dos côndilos femorais dos camundongos oim, previamente irradiados. O bioensaio para comparação entre essas duas células apresentou resultados positivos em relação à ação das CTM-TA sobre a melhora da qualidade óssea dos fêmures destes animais, através da dosagem da cadeia αII (I) do colágeno tipo I, e sobretudo pelos resultados significativos (P < 0,05) obtidos na avaliação biomecânica. Desta forma, esta linhagem foi escolhida para o bioensaio de avaliação pré-clínica, associando o transplante alogênico destas células à eletroporação do gene do mGH. As técnicas utilizadas foram baseadas em protocolos pré-clínicos realizados por nosso grupo de terapia gênica, tanto para a melhora fenotípica de modelos GH-deficientes, quanto para a de camundongos oim heterozigotos. Os resultados revelaram que a associação entre a terapia gênica in vivo e o transplante das CTM-TA foi estatisticamente significativa (P < 0,05) em relação ao controle negativo para praticamente todos os parâmetros avaliados, mostrando que estas células possuem sua atividade reparadora, possivelmente, potencializada pela super expressão do mGH. Coletivamente, os dados encontrados neste trabalho abrem novos horizontes para o entendimento da ação das CTM-TA na reparação tecidual, assim como o papel anabolizante do GH sobre a melhora do fenótipo da OI tipo I.
Title in English
Electrotransference of the mouse growth hormone gene associated with the administration of mesenchymal stem cells, in a murine model of osteogenesis imperfecta
Keywords in English
cell therapy
gene therapy
growth hormone
in vivo electrotransfer
mesenchymal stem cells
oim mouse
osteogenesis imperfecta
Abstract in English
Pre-clinical and clinical trials of cell and gene therapy have been developed and applied in a very promising manner, through the latest decades, facing the search for the cure or the effective improvement of several genetic disorders. Our Gene Therapy group of the Biotechnology Center, at IPEN, holds vast experience on in vivo delivery of plasmid DNA containing human growth hormone (hGH) and murine (mGH) genes for the treatment of GH-deficient mice, developing protocols that showed very relevant results in the last 10 years. Thus, in this work we propose a novel approach based on the association between in vivo gene therapy and allogeneic transplant of mesenchymal stem cells for treating osteogenesis imperfecta (OI) in a murine model, the oim mice. The main feature of OI is the bone fragility caused, mainly, by mutations in the genes that synthesize or process type I collagen, and in those responsible for osteoblast maturation. Initially, we evaluated two lineages of mesenchymal stem cells (MSCs) extracted from two different tissues, bone marrow (BM-MSC) and adipose tissue (AT-MSC), to comprehend which is the better bone healer on the oim mice femurs. These cells were applied locally through the femoral condyles of previously irradiated oim mice. The bioassay comparing these two types of cells showed positive results regarding the action of AT-MSC for the improvement of the femoral bone quality in these animals, through the dosage of the αII (I) chain of the type I collagen, and furthermore providing significant results (P < 0.05) acquired from biomechanics evaluation. Therefore, this lineage was chosen for the bioassay of pre-clinical evaluation, associating the allogeneic transplant of these cells to the electroporation of the mGH gene. The techniques applied were based on pre-clinical protocols performed by our gene therapy group for the phenotypical improvement of both GH-deficient models and heterozygous oim mice. The results revealed that the association between in vivo gene therapy and AT-MSC transplantation was statistically significant (P < 0.05) versus negative control for practically all the evaluated parameters, demonstrating that these cells possess their reparative activity, possibly, potentialized by over expression of mGH. Collectively, the data reported in this work unveil new horizons for the understanding of the action of AT-MSC in tissue reparation, as well as for the anabolic role of GH over type I OI phenotype improvement.
 
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Publishing Date
2021-07-16
 
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