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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.85.2013.tde-10012014-142554
Documento
Autor
Nome completo
Beatriz Elane de Almeida
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2013
Orientador
Banca examinadora
Ribela, Maria Teresa de Carvalho Pinto (Presidente)
Alvarez, Rafael Herrera
Bartolini, Paolo
Dalmora, Sergio Luiz
Oliveira, João Ezequiel de
Título em português
Determinação de potência de diferentes preparações de foliculotrofina, luteotrofina e tireotrofina: comparação entre a quantificação por cromatografia líquida em fase reversa e por bioensaio in vivo
Palavras-chave em português
bioensaio
glicoproteicos
hormônios
potência
RP-HPLC
Resumo em português
Com a intenção de estabelecer métodos físico-químicos como uma alternativa ao bioensaio in vivo para determinação de atividade biológica, o conteúdo de hFSH, hTSH e hLH de diferentes preparações, nativas e recombinantes, foi determinado por cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) e comparado ao dado obtido pelo clássico bioensaio in vivo em camundongos ou ratos (BA). Para estes hormônios foi encontrada uma relação linear entre os dois métodos: hFSH BAUI = 0,9925 RP-HPLCUI - 1,3165, r = 0,9371, p < 0,001, n = 24; hTSH BAμg = 0,9790 RP-HPLCμg - 0,052, r = 0,8725 , p < 0,001, n = 14; hLH BAUI = 0,8771 RP-HPLCUI + 12,41; r = 0,9786, p < 0,01, n = 5. Para outras nove preparações de hFSH e onze preparações de hTSH foi determinada a diferença média (d) entre a bioatividade predita pela RP-HPLC através destas equações e da média das bioatividades obtidas com os dois métodos. Para o hLH não foi possível determinar esta diferença em virtude das poucas amostras disponíveis. No caso do hFSH, d ± DP = -2,11 ± 3,49 % sendo a precisão de 1,16% e no caso do hTSH, d ± DP = -2,01 ± 5,56 % com precisão de 1,68%. Amostras parcialmente alteradas apresentaram diferentes graus de atividade de hFSH, hTSH e hLH que puderam ser preditas por RP-HPLC com uma aceitável concordância com os bioensaios in vivo. Estes resultados demonstraram que o emprego de um ensaio físico-químico sem o uso de animais, tal como a RP-HPLC, é uma alternativa viável ao uso do bioensaio in vivo para a determinação da potência de hFSH e hTSH, reduzindo assim o número de animais em geral utilizados para assegurar a qualidade e eficácia de um produto farmacêutico.
Título em inglês
Potency determination of follitropin, lutropin and thyrotropin: a comparison between the quantification by reversed-phase high-performance liquid chromatography and in vivo bioassay
Palavras-chave em inglês
bioassay
glycoproteins
hormones
potency
RP-HPLC
Resumo em inglês
With the intention of setting up physico-chemical methods as an alternative to in vivo bioassay for determining biological activity, the hFSH, hTSH and hLH content of native and recombinant preparations was determined by reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) and compared with the data obtained by the classical mouse or rat in vivo bioassays (BA). A linear relationship between the two methods was found for these hormones: hFSH BAIU = 0.9925 RP-HPLCIU 1.3165, r = 0.9371, p < 0.001, n = 24; hTSH BAμg = 0.9790 RP-HPLCμg - 0.052, r = 0.8725, p < 0.001, n = 14; hLH BAIU = 0.8771 RP-HPLCIU + 12.41, r = 0.9786, p < 0.01, n = 5. For nine other hFSH and eleven hTSH preparations, the mean difference (d) between the bioactivity predicted from RP-HPLC data via these equations and the mean of the bioactivities obtained with the two methods was as follows. For hLH this difference could not be estimated due to lack of different samples. In the case of hFSH, d ± SD = -2.11 ± 3.49% with a precision of 1.16% and in the case of hTSH, d ± SD = -2.01 ± 5.56 %, with precision of 1.68%. Partly-degraded hFSH, hTSH and hLH samples presented different activity degrees that could be predicted by RP-HPLC, with an acceptable agreement with the in vivo bioassays. These results demonstrate that the employment of a non-animal physico-chemical assay, such as RP-HPLC, is a viable alternative to the use of an in vivo bioassay for hFSH and hTSH potency determination, thus reducing the number of animals currently used for assuring quality and efficacy of a pharmaceutical product.
 
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Data de Publicação
2014-01-14
 
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