Introdução: O Pirarucu (Arapaima gigas) é uma espécie de peixe nativa da bacia amazônica que pode alcançar até 200 kg e dois metros de comprimento. Alvo de pesca predatória e modificações ambientais, especialmente político-econômicas, já se nota um relativo declínio da população local e, segundo órgãos fiscalizadores, a espécie está em possível risco de extinção. Há ainda uma dificuldade no manejo em cativeiro, visto sua gama de necessidades nutricionais e comportamentos que ainda são investigados. A tireotrofina (TSH) atua no controle da reprodução em diferentes espécies de peixes. E do ponto de vista ecológico tem sua expressão modificada quando em contato com substâncias poluentes, como metais pesados e agrotóxicos. O TSH é uma glicoproteína de peso molecular variando de 24-28 kDa formada pela ligação não-covalente de duas subunidades alfa e beta, sendo a alfa comum para outros hormônios glicoproteicos, como o FSH, LH e CG. Sua função é bem estabelecida, participando diretamente na síntese dos hormônios tireoidianos (HTs) que atuam no desenvolvimento embrionário, modulação da atividade cerebral, gonadal, hepática, entre outros. Objetivos: Obter a subunidade beta do TSH de Arapaima gigas, caracterizar sua estrutura in silico e expressar em células de mamífero. Metodologia: Foram utilizadas metodologias de identificação genômica da subunidade beta in silico e construção da estrutura do heterodímero com técnicas de inteligência artificial. Aplicou-se duas ferramentas de predição: gênica (Gnomon) e estrutural (Alphafold), como também se realizou in silico estudos sobre distância evolutiva, dinâmica molecular e propriedades físico-químicas. As informações recuperadas das predições foram em parte confirmadas com PCR de hipófises retiradas de Pirarucus e a expressão de agTSH em células de mamífero HEK293F. Resultados: A similaridade da cadeia beta variou de 40,10-81,60% entre 39 espécies alinhadas com a sequência obtida. São 146 aminoácidos com 12 cisteínas (que formam seis pontes dissulfeto) e um único sítio de N-glicosilação conservados. A árvore filogenética construída indica maior grau de parentesco com a ordem elopiformes e clupeiformes. A estrutura do heterodímero é majoritariamente polar, com predominância de folhas-beta na sua estrutura secundária, sendo uma citocina com nó de cistina (CATH 2.10.90.10). Os estudos de dinâmica molecular da interação do TSH com receptor do seu ancestral comum, Aruanã-dourado (S. formosus), ambos resolvidos por Alphafold, apontam valores comparáveis ao modelo humano, com diferença de valores relacionados a energia de ligação (ΔG) entre 1,50-8,64%, indicando um caminho para estudos in vitro e in vivo. Sua expressão, feita de maneira transiente, obteve rendimento de agTSH 25 mg/L, similar a trabalho anterior com agFSH 28 mg/L, quantificados através de técnicas cromatográficas no meio condicionado. Conclusões: A região codificante e 3' não traduzida da subunidade beta foi identificada e utilizada juntamente com a subunidade alfa para a produção de agTSH em células HEK293. A metodologia utilizada poderá ser aplicada para que novas proteínas da espécie sejam descritas. Muito embora ainda requeria otimização para aumento da expressão, este trabalho contribuirá para que futuros estudos explorem sua atividade biológica, investigando a eficiência quanto à reprodução e melhoria da capacidade reprodutiva em cativeiro do pirarucu.

Introduction: The Pirarucu (Arapaima gigas) is a specie of fish native to the Amazon basin that can reach up to 200 kg and two meters in length. Targeted by predatory fishing and environmental changes, especially political-economic, it's already noted a relative decline of the local population and, according to enforcement agencies, the species is at possible risk of extinction. Also remain a difficulty in the management in captivity, given its range of nutritional needs and behaviors that are still being studied. Thyrotropin (TSH) has activity on the in different fish species. From the ecology point of view, your expression changes when in contact with contaminating substances, such as heavy metals and pesticides. TSH is a glycoprotein of molecular weight ranging from 24-28 kDa formed by the non-covalent bonding of two subunits, alpha and beta, once alpha being common to other glycoprotein hormones, such as FSH, LH and CG. Your function is well established, participating directly in the synthesis of thyroid hormones (THs) that act, among other functions, in embryonic development, modulation of brain, gonadal and liver activity. Objectives: Obtain the beta subunit of TSH from Arapaima gigas, characterize the structure in silico and express in mammalian cells. Methodology: We used methodologies of in silico genomic identification of the beta subunit and construction of the heterodimer structure with artificial intelligence techniques. Two prediction tools were applied: genomic (Gnomon) and structural (Alphafold), as well as explored in silico with evolutionary distance, molecular dynamics and physicochemical properties studies. The information recovered from the predictions was partly confirmed with PCR reaction of pituitary glands taken from Pirarucus and the expression of agTSH in HEK293F mammalian cells. Results: The beta chain similarity ranged from 40.10-81.60% among 39 species aligned with the obtained sequence. There are 146 amino acids with 12 cysteines (which form six disulfide bridges) and a single N-glycosylation site conserved. The constructed phylogenetic tree indicates may degree of kinship with the order Elopiformes and Clupeiformes. The structure of the heterodimer is mostly polar, with a predominance of beta-sheet in the secondary structure, classified as a Cystine-knot cytokines (CATH 2.10.90.10). Molecular dynamics studies of the interaction of TSH with receptor of its common ancestor, Asian arowana (S. formosus), both solved by Alphafold, point to values comparable to the human model, with a difference in binding energy (ΔG) related values between 1.50-8.64%, indicating a pathway for in vitro and in vivo studies. The transient expression in mammalian cells obtained a yield of agTSH 25 mg/L, similar to previous work with agFSH 28 mg/L), quantified by chromatographic techniques in the conditioned medium. Conclusions: Beta subunit coding sequence and untranslated 3' region was identified and used in combination with alpha subunit to HEK293F protein expression. The methodology used could be applied in order to new proteins of the specie being described. Although requires optimization to enhance the expression, this work contributed to future studies to explore your biological activity, looking for the efficiency on the reproduction and improvement of reproduction capacity in Pirarucu captivity.