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Mémoire de Maîtrise
DOI
10.11606/D.85.2009.tde-06112009-143353
Document
Auteur
Nom complet
Renata Damiani
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2009
Directeur
Jury
Ribela, Maria Teresa de Carvalho Pinto (Président)
Bartolini, Paolo
Glezer, Andrea
Titre en portugais
Expressão estável de tireotrofina humana (r-hTSH) em células de mamífero CHO que expressam 2,6-sialiltransferase
Mots-clés en portugais
3-ligado
6-ligado
ácido siálico a2
Células CHO
N-glicanos.
Sialilação humanizada
Tireotrofina
Resumé en portugais
Uma linhagem celular de CHO, previamente modificada geneticamente pela introdução de cDNA da 2,6 sialiltransferase de rato, gerou, pela primeira vez, um hTSH recombinante com sialilação humanizada (hlsr-hTSH), mais similar ao hormônio nativo, com 61% de ligação de ácido siálico na conformação 2,3 e 39%, na conformação 2,6. O clone mais produtivo, quando submetido à amplificação gênica com 8 M de metotrexato, apresentou um nível de secreção de aproximadamente 2 g de hTSH/106 células/dia, nível este útil para a purificação e caracterização do produto. A massa molecular relativa do heterodímero e das subunidades e do hlsr-hTSH purificado, determinada por espectrometria de massa MALDI-TOF, e a hidrofobicidade relativa, determinada por RP-HPLC, não apresentaram diferenças significativas com relação às preparações de hTSH recombinante derivadas de células CHO sem a modificação devida ao gene da 2,6 sialiltransferase. Entretanto, algumas diferenças foram observadas na composição dos N-glicanos, com mais estruturas tri- e tetra-sialiladas no hlsr-hTSH. O hlsr-hTSH mostrou-se eqüipotente (p>0,05) à preparação comercial de r-hTSH (Thyrogen) e 1,5 vezes mais potente do que a preparação nativa de hTSH (p<0,001), quando analisado por um bioensaio in vivo baseado na capacidade do TSH de estimular a liberação de T4.
Titre en anglais
STABLE EXPRESSION OF HUMAN THYROTROPIN (hTSH) IN MAMMALIAN CELLS (CHO) EXPRESSING 2,6 SIALYLTRANSFERASE
Mots-clés en anglais
3-ligado
6-ligado
Ácido siálico a2
Células CHO
N-glicanos.
Sialilação humanizada
Tireotrofina
Resumé en anglais
A CHO cell line, previously genetically modified by the introduction of rat 2,6-sialyltransferase cDNA, generated for the first time a human-like sialylated recombinant hTSH (hlsr-hTSH) more similar to the native hormone, with 61% of 2,3- and 39% of 2,6-linked sialic acid residues. The best clone, when submitted to gene amplification with up to 8 M methotrexate, presented a secretion level of ~2 g hTSH/106 cells/day, useful for product purification and characterization. The relative molecular masses (Mr) of the heterodimer and of the - and -subunits of purified hlsr-hTSH, determined by MALDI-TOF mass spectrometry, and the relative hydrophobicities, determined by RP-HPLC, were not remarkably different from those presented by two r-hTSH preparations secreted by normal CHO cells. Some differences were observed, though, in N-glycan composition, with more tri- and much more tetra-sialylated structures in hlsr-hTSH. When analyzed via an in vivo bioassay based on hTSH-induced T4 release in mice, hlsr-hTSH was shown to be equipotent (p > 0.05) with the commercial preparation of r-hTSH (Thyrogen), and 1.5-fold more potent than native hTSH (p < 0.001).
 
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RenataDamiani.pdf (1.63 Mbytes)
Date de Publication
2009-11-27
 
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