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Mémoire de Maîtrise
DOI
https://doi.org/10.11606/D.85.2020.tde-03022020-094942
Document
Auteur
Nom complet
David Peters dos Santos
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2018
Directeur
Jury
Dias, Ligia Ely Morganti Ferreira (Président)
Barbosa, Ângela Silva
Ramos, Carlos Henrique Inacio
Titre en portugais
Renaturação da proteína de envelope do vírus da zika e do domínio III da mesma proteína utilizando altas pressões
Mots-clés en portugais
biologia molecular
biotecnologia
corpos de inclusão de ZIKV
renaturação de proteínas
Resumé en portugais
Grande parte das proteínas de importância biomédica são encontradas em concentrações pequenas nas suas formas nativas. Uma alternativa para obtenção de proteínas em grande escala é síntese por bactérias Escherichia coli geneticamente modificadas. Entretanto, frequentemente essas proteínas são produzidas como agregados insolúveis e inativos, denominados de corpos de inclusão (CI). Para se tornarem bioativas as proteínas nos CI devem ser renaturadas. O nosso objetivo foi o estabelecimento de um processo rápido e eficiente de obtenção da proteína de envelope (E) e do domínio III desta mesma proteína (EDIII) do vírus da ZIKA (ZIKV) solúveis e com atividade imunológica a partir de CI. A utilização destas proteínas se justifica pela sua relevância para o desenvolvimento de ensaios diagnósticos e para a produção de vacinas de ZIKV. A associação de alta pressão e pH alcalino se mostrou eficiente para a solubilização dos CI. A incubação dos CI em alta pressão (2,4 kbar por 90 min e 0,4 kbar por 14,5 h) em pH de 10,5 foi a melhor condição encontrada na qual foi obtida solubilização eficiente dos CI com baixa desnaturação proteica. O enovelamento das proteínas presentes nos sobrenadantes das suspensões submetidas à alta pressão foi obtido por diálise em tampão em pH de 8,5. A recuperação do E solúvel nesta condição foi de mais de 90% e a de EDIII foi de 80% em relação às quantidades totais dessas proteínas nos CI e os rendimentos foram de 130 mg de E e de 35 mg de EDIII/L de cultura bacteriana. As proteínas E e EDIII permaneceram imunologicamente ativas e foram recuperadas principalmente como monômeros e dímeros. O procedimento proposto representa uma alternativa para a produção de proteínas recombinantes imunologicamente ativas expressas como CI.
Titre en anglais
Refolding of zika virus envelope protein and domain III of the same protein using high pressures
Mots-clés en anglais
biotechnology
inclusion bodies of ZIKV
molecular biology
renaturation of proteins
Resumé en anglais
Most proteins of biomedical importance are found in small concentrations in their native forms. An alternative for obtaining large-scale proteins is synthesis by genetically modified Escherichia coli bacteria. However, these proteins are often produced as insoluble and inactive aggregates, called inclusion bodies (IBs). To become bioactive, the proteins in the IB must be refolded. Our objective was to set up a fast and efficient process to obtain soluble and immunologically active ZIKA virus (ZIKV) envelope protein (E) and its domain III (EDIII) from IB. The use of these proteins is justified by their relevance for the development of diagnostic tests and production of ZIKV vaccines. The association of high pressure and alkaline pH was shown to be efficient for IB solubilization. The incubation of the IB at high pressure (2.4 kbar for 90 min and 0.4 kbar for 14.5 h) at a pH of 10.5 was the best condition found in which efficient IB solubilization and low protein denaturation was obtained. The folding of the proteins present in the supernatants of suspensions subjected to high pressure was obtained by dialysis in buffer at pH 8.5. The recovery of the soluble E in this condition was higher than 90% and that of EDIII was of 80 % relative to the total amounts of those proteins in the IB and the yields were of 130 mg of E and of 35 mg of EDIII/L bacterial culture. E and EDIII proteins remained immunologically active and were recovered mainly as monomers and dimers. The proposed procedure represents an alternative for the production of immunologically active recombinant proteins expressed as IB.
 
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Date de Publication
2020-02-07
 
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