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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.82.2020.tde-24082021-173940
Document
Author
Full name
Larissa Souza Amaral
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Carlos, 2020
Supervisor
Committee
Perussi, Janice Rodrigues (President)
Anibal, Fernanda de Freitas
Azevedo, Eduardo Bessa
Leitão, Andrei
Rastelli, Alessandra Nara de Souza
Ribeiro, Anderson Orzari
Title in Portuguese
Erradicação de biofilmes bacterianos mono e multiespécies pela terapia fotodinâmica utilizando a microbiologia preditiva multivariada e novos fotossensibilizadores
Keywords in Portuguese
Enterococcus faecali
Estafilococos aureus resistente a meticilina
Biofilmes Bacterianos
Microbiologia Preditiva, Planejamento Fatorial
Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana
Abstract in Portuguese
Estima-se que em 2050 a mortalidade por infecções causadas por bactérias resistentes chegue a 10 milhões de casos por ano. Devido à resistência bacteriana é prioritário o desenvolvimento de novas drogas e/ou tecnologias para a erradicação desses patógenos. A Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (TFD-A) é uma alternativa promissora, uma vez que sua ação ocorre por múltiplos alvos o que dificultaria o desenvolvimento de resistência. TFD-A envolve a combinação de um fotossensibilizador (FS), oxigênio molecular e luz visível de comprimento de onda adequado para produzir espécies reativas de oxigênio (EROs) levando o microrganismo à morte. O objetivo desse estudo foi utilizar técnicas variadas para evidenciar a fotoinativação de biofilmes bacterianos mono e multiespécies via TFD-A empregando-se a microbiologia preditiva e novos FSs ainda não utilizados para essa aplicação. O uso da microbiologia preditiva utilizando o Planejamento Fatorial 23 propiciou o entendimento particularizado e aprofundado dos melhores parâmetros bem como seus níveis, suas interações e os efeitos individuais em cada condição. A clorina CHL-OH-A possibilitou uma fotoinativação maior dos biofilmes de E. coli (39 e 62%), E. faecalis (79 e 92%) e multiespécies (48 e 72%) enquanto que a CHL-Ph-A para o biofilme de S. aureus resistente à meticilina (53 e 89%) nos dois comprimentos de onda utilizados (660 e 403 nm), respectivamente. A Microscopia Eletrônica de Varredura possibilitou a observação da alteração morfológica tanto das bactérias quanto da estrutura do biofilme. A Microscopia de Fluorescência (MF) permitiu comprovar a evasão citoplasmática decorrente da peroxidação da bicamada fosfolipídica, também observada pela Espectroscopia Vibracional de Absorção na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier. A MF também foi importante para validar, qualificar e quantificar a acumulação das clorinas em biofilmes através da análise de intensidade × pixels. A Microespectroscopia Raman permitiu a observação dos biocomponentes bacterianos que podem ser possíveis alvos do processo fotodinâmico. A Microscopia Ótica bem como a Espectroscopia de absorção no visível utilizando safranina 1% foram essenciais para visualizar e constatar a desestruturação da matriz exopolissacarídica bem como quantificar a biomassa do biofilme, respectivamente. Potencializar os efeitos fotodinâmicos com iodeto de potássio (KI)foi crucial para a obtenção de menores índices de sobrevivência bacteriana chegando a 100% de erradicação para E. faecalis e S. aureus resistente à meticilina. Ensaios de seletividade com Balb 3T3 Clone A31 e de hemólise dos eritrócitos foram fundamentais para a compreensão dos efeitos que as clorinas e os comprimentos de onda da luz usados na irradiação durante a TFDA tem sobre a membrana citoplasmática de células eucarióticas. A comparação da TFD-A com o uso do antibiótico de largo espectro foi importante para observar a eficiência da técnica. Esses resultados mostram as vantagens e a importância de uma abordagem multivariada em experimentos que envolvam a TFD-A. Além disso, este estudo chama a atenção para os benefícios do uso de metodologias que possam evidenciar o efeito antimicrobiano além da constatação típica da morte celular. Além do mais, foi comprovado que as novas clorinas apresentam elevado potencial fotodinâmico in vitro, sendo ótimas candidatas como fotossensibilizador em abordagens clínicas.
Title in English
Eradication of single and multi-species bacterial biofilms by photodynamic therapy using multivariate predictive microbiology and new photosensitizers
Keywords in English
Escherichia coli
Antimicrobial Photodynamic Therapy, Predictive Microbiology
Factorial Design, Bacterial Biofilm
Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis
Abstract in English
By 2050 mortality due to infections caused by resistant bacteria is estimated to reach 10 million cases per year. As a result of the bacterial resistance, the development of new drugs and technologies for the eradication of these pathogens is a priority. Antimicrobial Photodynamic Therapy (A-PDI) can solve this problem since its action occurs by multiple targets, which would hinder the development of resistance. A-PDI involves the combination of a photosensitizer (PS), molecular oxygen, and visible light suitable to produce reactive oxygen species (ROS), leading the microorganisms to death. The objective of this study was to use varied techniques to evidence the photoinactivation of single and multi-species bacterial biofilms via A-PDI using predictive microbiology and new PSs not yet used for this applicability. The use of predictive microbiology using Factorial Design 23 has provided, in a multivariate and unprecedented way, a detailed and in-depth understanding of the best parameters as well as their levels, their interactions, and the personal effects in each condition. CHL-OH-A enabled greater photoinactivation of E. coli (39 and 62%), E. faecalis (79 and 92%) and multi-species (48 and 72%) biofilms, while CHL-Ph-A for methicillin-resistant S. aureus biofilm (53 and 89%) for both used wavelengths of 660 and 403 nm, respectively. Scanning Electron Microscopy made it possible to observe the morphological alteration of both bacteria and biofilm structure. Fluorescence microscopy (FM) allowed proving cytoplasmic evasion due to phospholipid bilayer peroxidation, also observed by Fourier Transform Infrared Absorption Vibrational Spectroscopy. FM was also essential to validate, qualify, and quantify chlorin accumulation in biofilms through intensity × pixel analysis. Raman microspectroscopy allowed the observation of bacterial biocomponents that may be possible targets of the photodynamic process. Optical microscopy, as well as visible absorption spectroscopy using 1% safranin, were essential to visualize and verify the disruption of the exopolysaccharide matrix as well as to quantify the biofilm biomass, respectively. Potentiating the photodynamic effects with potassium iodide was crucial to achieving lower bacterial survival rates reaching 100% eradication for methicillin-resistant S. aureus and E. faecalis. Balb 3T3 Clone A31 selectivityand erythrocyte hemolysis assays were critical for understanding the effects that chlorins, light wavelengths used during A-PDI on the cytoplasmic membrane of eukaryotic cells. A comparison of A-PDI with the use of broad-spectrum antibiotic was essential to visualize APDI efficiency. These results show the advantages and importance of a multivariate approach in experiments involving A-PDI. Besides, this study draws attention to the benefits of using methodologies that may highlight the antimicrobial effect beyond the typical finding of cell death. Moreover, it has been shown that the new chlorins have high photodynamic potential in vitro and are a great candidate as photosensitizers in clinical approaches.
 
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Publishing Date
2021-08-25
 
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