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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.76.2022.tde-31012023-154306
Documento
Autor
Nome completo
Karen Jochelavicius
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Carlos, 2022
Orientador
Banca examinadora
Oliveira Junior, Osvaldo Novais de (Presidente)
Araujo, Ana Paula Ulian de
Faez, Roselena
Philadelphi, Laura Oliveira Peres
Ruggiero Neto, Joao
Título em inglês
Effects caused by water-soluble chitosans with high molecular weight in bacterial and mammal membrane models using Langmuir monolayers
Palavras-chave em inglês
Bactericide activity
Chitosan
Langmuir monolayers
Resumo em inglês
Lipid monolayers are well-known systems that mimic cell membrane environments, being used in a variety of studies involving molecules that affect the membrane structure. Incorporation of chitosans into lipid monolayers is known to cause expansion and, mostly, fluidization, having stronger effects on negatively charged monolayers and with low molecular weight chitosans. These effects are attributed to a combination of electrostatic and hydrophobic interactions, correlating well with the stronger interactions with the negatively charged bacterial cell membranes than for mammalian membranes. In this thesis, we shall present results that challenge these interpretations. First, we employ water-soluble chitosans that induce larger effects on zwitterionic phospholipids, namely dipalmitoyl phosphatidyl ethalonamine (DPPE) and dipalmitoyl phosphatidyl choline (DPPC), than on negatively charged dipalmitoyl phosphatidyl glycerol (DPPG). Slightly stronger effects are induced on the lipid extract of Escherichia coli (E. coli), except when compared to DPPE on acetate buffer. Even more relevant is the effect induced on monolayers prepared with a ternary mixture of DPPC, cholesterol (Chol) and sphingomyelin (SM) (SM-DPPC-Chol), which represents lipid rafts, for which effects appear at chitosan concentrations that are orders of magnitude smaller than reported in the literature for other chitosans or types of monolayer. The differences from the literature may be attributed to the high acetylation degree of one of the chitosans used, named Ch35% as it has a 35% acetylation degree. The charge in Ch35% was not sufficient for the electrostatic interactions to predominate over the hydrophobic interactions. The importance of charge availability for such interactions was confirmed by the larger monolayer expansion induced by Ch15%, a chitosan with 15% acetylation degree. Because both chitosans were water soluble, experiments could be made with subphases at physiological pH and at an acidic pH. Ch35% tend to have larger effects on monolayers deposited on the acidic pH, with a few exceptions when the larger volume occupied by the chitosan at a high pH led to larges expansions. Surprisingly, Ch15% induced larger effects on physiologic pH when incorporated in E. coli lipids, and this remains an open point. Also worth mentioning is that Ch35% and Ch15% have high molecular weights, ca. 106 g mol1, and still produced stronger effects than low molecular weight chitosans in previous studies, again contradicting expectations from the literature. In one hand, the larger effects induced on lipid rafts than on E. coli lipid extract calls for caution in the possible use of chitosans as bactericide agent; on the other hand, we observed a significant effect of Ch35% on monolayers of lipopolysaccharides (LPS), which represent the external wall of Gram-negative bacteria. Taken together, the results presented here indicate that charge availability and distribution in chitosans are probably the most important factor for their interaction with Langmuir monolayers, and the findings related to physiological pH and lipid rafts require a thorough revisit of studies on cell membrane models.
Título em português
Efeitos causados por quitosanas solúveis em água e de alta massa molar em modelos de membrana de mamíferos e bactérias, usando monocamadas de Langmuir.
Palavras-chave em português
Atividade bactericida
Monocamadas de Langmuir
Quitosana
Resumo em português
Monocamadas lipídicas são sistemas conhecidos por mimetizarem membranas celulares, sendo usadas em uma variedade de estudos envolvendo moléculas que afetam a estrutura da membrana. Sabe-se que a incorporação de quitosanas em monocamadas lipídicas causa expansão e, em sua maioria, fluidização, com efeitos mais fortes em monocamadas carregadas negativamente e com quitosanas de baixa massa molar. Esses efeitos são atribuídos a interações eletrostáticas e hidrofóbicas, correlacionando bem com interações mais fortes com a parede celular negativa de bactérias do que com membranas de mamíferos. Nesta tese, apresentaremos resultados que desafiam essas interpretações. Primeiramente, empregamos quitosanas solúveis em água que induzem efeitos maiores nos fosfolipídios zwiteriônicos dipalmitoil etanolamina (DPPE) e dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC) do que no aniônico dipalmitoil fosfatidilglicerol (DPPG). Efeitos levemente maiores são induzidos no extrato lipídico de E. coli, exceto quando comparado com DPPE em tampão acetato. Mais relevante ainda é o efeito induzido em monocamadas compostas pela mistura ternária de DPPC, colesterol (Chol) e esfingomielina (SM) (SM-DPPC-Chol), que representa as jangadas lipídicas, para as quais aparecem efeitos com concentrações de quitosana que são ordens de magnitude do que reportado na literatura para outras quitosanas ou outros tipos de monocamada. As diferenças com a literatura podem ser atribuídas ao alto grau de acetilação de uma das quitosanas usadas, chamada de Ch35% por ter um grau de acetilação de 35%. A carga da Ch35% não foi suficiente para interações eletrostáticas predominarem sobre as hidrofóbicas. A importância da disponibilidade e da disposição de cargas para tais interações foi confirmada pela maior expansão das monocamadas induzida pela Ch15%, uma quitosana com grau de acetilação de 15%. Como ambas as quitosanas são solúveis em água, os experimentos puderam ser feitos em pHs fisiológico e ácido. A Ch35% tende a produzir efeitos maiores em monocamadas depositadas em pH ácido, salvas algumas exceções quando o volume ocupado pela quitosana em um pH alto levou a expansões maiores. Surpreendentemente, a Ch15% induziu efeitos maiores em pH fisiológico quando com lipídios de E. coli, e esse ponto ainda está em aberto. Mencione-se que a Ch35% e a Ch15% têm alta massa molar, cerca de 106 g mol1, e ainda produzem efeitos maiores em que quitosanas de baixa massa molar em estudos anteriores, novamente contradizendo expectativas da literatura. Por um lado, os efeitos induzidos em jangadas lipídicas maiores do que no extrato de E. coli sugerem cautela no uso de quitosanas como agentes bactericidas; por outro, um efeito significativo foi observado em monocamadas de lipopolissacarídeos (LPS), que representam a membrana externa de bactérias Gram-negativas. Somados, os resultados apresentados aqui indicam que a disponibilidade e a disposição de cargas nas quitosanas são provavelmente o aspecto mais importante para a sua interação em monocamadas de Langmuir, e as descobertas relacionadas ao pH fisiológico e às jangadas lipídicas apontam para a necessidade de uma detalhada reanálise dos estudos em membranas celulares.
 
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Data de Publicação
2023-01-31
 
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