Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh, conhecida como camu-camu ou araçá dagua, é uma fruta nativa da Amazônia, caracterizada por seu alto teor de L-Ácido Ascórbico (Vitamina C ou AsA). Devido a esta propriedade, as enzimas que participam da biossíntese de AsA poderiam ter potenciais aplicações biotecnológicos para a produção artificial de AsA. No entanto, a biologia estrutural das enzimas envolvidas tem sido bem pouco explorada. Aqui, descrevemos as propriedades biofísicas, funcionais e estruturais para três enzimas da via D-manose/L-galactose (Smirnoff & Wheeler). As enzimas foram purificadas por cromatografia de afinidade e exclusão molecular. GDP-D-manose-3,5-epimerase (MdGME), que catalisa uma dupla epímerização da GDP-manose para produzir GDP-L-galactose e GDP-L-gulose, provou ser um dímero em solução, suas estruturas cristalográficas foram resolvidas complexadas, sua forma apo (2,5 Å, ligada a NAD⁺) e holo (1.25 Å ligada a NAD⁺/substrato/produto). A L-galactose desidrogenase (MdGDH) e L-galactono-1,4lactona desidrogenase (MdGalDH) provaram ser monoméricas em solução. MdGDH apresentou uma atividade catalítica com um K_m de 0,128 mM e pH ótimo de 7. Demostramos que a inibição por AsA em MdGDH é devido a mudanças no pH e não necessariamente por uma inibição competitiva pelo sítio ativo como foi reportada para a enzima homóloga de espinafre (SoGDH). A estrutura cristalográfica de SoGDH foi resolvida a 1,4 e 1,75 Å em suas formas apo e holo (ligado a NAD⁺), respectivamente. Finalmente a MdGalDH apresentou uma atividade catalítica com um K^m de 0,044 mM e pH ótimo de 8 e apresentou uma inibição pelo próprio substrato. A estrutura cristalográfica foi resolvida a 2,1 Å. O presente trabalho contribui para uma compreensão mais amplo das relações estrutura-função das enzimas envolvidas na síntese da vitamina C.

Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh, known as camu-camu or aracá dagua, is a fruit native to the Amazon, characterized by its high content of L-Ascorbic Acid (Vitamin C or AsA). Due to this property, the enzymes that participate in the biosynthesis of AsA could have potential biotechnological applications for the artificial production of AsA. However, the structural biology of the enzymes involved has been poorly explored. Here, we describe the biophysical, functional, and structural properties for three enzymes of the D-mannose/L-galactose pathway (Smirnoff & Wheeler). The enzymes are purified by affinity chromatography and molecular exclusion. GDP-D-mannose-3´,5´-epimerase (MdGME), which catalyzes a double epimerization of GDP-mannose to produce GDP-L-galactose and GDP-L-gulose, proved to be a dimer in solution, its crystallographic structure was solved, in both its apo (2.5 Å, bound to NAD⁺) and holo (1.25 Å bound to NAD⁺/substrate/product) form. L-galactose dehydrogenase (MdGDH) and L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase (MdGalDH) proved to be monomeric in solution. MdGDH showed a catalytic activity with a K_m of 0.128 mM and an optimal pH of 7. We show that inhibition by AsA in MdGDH is due to pH changes and is not necessarily due to a competitive inhibition at its active site as reported for the homologous enzyme of spinafre (SoGDH). The crystallographic structure of SoGDH was solved at 1.4 and 1.75Å in its apo and holo (NAD⁺-bound) forms, respectively. Finally, MdGalDH showed a catalytic activity with a K_m of 0.044 mM and an optimal pH of 8 and was inhibited by its own substrate. The crystallographic structure was solved to 2.1 Å. The present work contributed to a broader understanding of the structure-function relationships of enzymes involved in the synthesis of vitamin C.