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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.76.2023.tde-30032023-113047
Documento
Autor
Nome completo
Jhon Antoni Vargas Santillan
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Carlos, 2023
Orientador
Banca examinadora
Garratt, Richard Charles (Presidente)
Marana, Sandro Roberto
Sluys, Marie Anne van
Título em português
Caracterização estrutural e funcional de três enzimas com potencial uso biotecnológico da rota biossintética D-manose/L-galactose do ácido L-ascórbico de Myrciaria dubia "camu-camu"
Palavras-chave em português
Myrciaria dubia "camu-camu."
Biossíntese de vitamina C
Cinética enzimática
Espinafre
Estrutura cristalográfica
Resumo em português
Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh, conhecida como camu-camu ou araçá dagua, é uma fruta nativa da Amazônia, caracterizada por seu alto teor de L-Ácido Ascórbico (Vitamina C ou AsA). Devido a esta propriedade, as enzimas que participam da biossíntese de AsA poderiam ter potenciais aplicações biotecnológicos para a produção artificial de AsA. No entanto, a biologia estrutural das enzimas envolvidas tem sido bem pouco explorada. Aqui, descrevemos as propriedades biofísicas, funcionais e estruturais para três enzimas da via D-manose/L-galactose (Smirnoff & Wheeler). As enzimas foram purificadas por cromatografia de afinidade e exclusão molecular. GDP-D-manose-3,5-epimerase (MdGME), que catalisa uma dupla epímerização da GDP-manose para produzir GDP-L-galactose e GDP-L-gulose, provou ser um dímero em solução, suas estruturas cristalográficas foram resolvidas complexadas, sua forma apo (2,5 Å, ligada a NAD+) e holo (1.25 Å ligada a NAD+/substrato/produto). A L-galactose desidrogenase (MdGDH) e L-galactono-1,4lactona desidrogenase (MdGalDH) provaram ser monoméricas em solução. MdGDH apresentou uma atividade catalítica com um Km de 0,128 mM e pH ótimo de 7. Demostramos que a inibição por AsA em MdGDH é devido a mudanças no pH e não necessariamente por uma inibição competitiva pelo sítio ativo como foi reportada para a enzima homóloga de espinafre (SoGDH). A estrutura cristalográfica de SoGDH foi resolvida a 1,4 e 1,75 Å em suas formas apo e holo (ligado a NAD+), respectivamente. Finalmente a MdGalDH apresentou uma atividade catalítica com um Km de 0,044 mM e pH ótimo de 8 e apresentou uma inibição pelo próprio substrato. A estrutura cristalográfica foi resolvida a 2,1 Å. O presente trabalho contribui para uma compreensão mais amplo das relações estrutura-função das enzimas envolvidas na síntese da vitamina C.
Título em inglês
Structural and functional characterization of three enzymes with potential biotechnological use from the D-mannose/L-galactose biosynthetic pathway of L-ascorbic acid from Myrciaria dubia camu-camu
Palavras-chave em inglês
Myrciaria dubia "camu-camu."
Biosynthesis of vitamin C
Crystallographic structure
Enzymatic kinetics
Spinafre
Resumo em inglês
Myrciaria dubia (Kunth) McVaugh, known as camu-camu or aracá dagua, is a fruit native to the Amazon, characterized by its high content of L-Ascorbic Acid (Vitamin C or AsA). Due to this property, the enzymes that participate in the biosynthesis of AsA could have potential biotechnological applications for the artificial production of AsA. However, the structural biology of the enzymes involved has been poorly explored. Here, we describe the biophysical, functional, and structural properties for three enzymes of the D-mannose/L-galactose pathway (Smirnoff & Wheeler). The enzymes are purified by affinity chromatography and molecular exclusion. GDP-D-mannose-3´,5´-epimerase (MdGME), which catalyzes a double epimerization of GDP-mannose to produce GDP-L-galactose and GDP-L-gulose, proved to be a dimer in solution, its crystallographic structure was solved, in both its apo (2.5 Å, bound to NAD+) and holo (1.25 Å bound to NAD+/substrate/product) form. L-galactose dehydrogenase (MdGDH) and L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase (MdGalDH) proved to be monomeric in solution. MdGDH showed a catalytic activity with a Km of 0.128 mM and an optimal pH of 7. We show that inhibition by AsA in MdGDH is due to pH changes and is not necessarily due to a competitive inhibition at its active site as reported for the homologous enzyme of spinafre (SoGDH). The crystallographic structure of SoGDH was solved at 1.4 and 1.75Å in its apo and holo (NAD+-bound) forms, respectively. Finally, MdGalDH showed a catalytic activity with a Km of 0.044 mM and an optimal pH of 8 and was inhibited by its own substrate. The crystallographic structure was solved to 2.1 Å. The present work contributed to a broader understanding of the structure-function relationships of enzymes involved in the synthesis of vitamin C.
 
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Data de Publicação
2023-03-31
 
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