The energetic and biosynthetic demands in cancer are linked to the alteration of many pathways in the cell. One of the main changes occurs in glutaminolysis; glutamine is one of the essential nutrients for tumor metabolism and is converted into glutamate by the glutaminase enzymes, encoded in mammals by two distinct genes, GLS and GLS2. Among the existing isoforms, Glutaminase C (GAC) is crucial and found in abundance in different tumor lineages. It can be found in different oligomeric states with varying efficiency, and the most active type is characterized by the formation of helical filaments (fGAC) in the presence of inorganic phosphate (Pi). However, the molecular mechanism by which oligomerization and increased activity arise is still elusive. Therefore, this project aims to discuss a novel model proposed by our group through the combination of cryo-electron microscopy (cryo-EM) and biochemical studies of the wild-type or modified protein. To this end, site-directed mutagenesis was performed in residues from regions of the suggested interaction interface and activation loop. Wildtype mouse GAC and its mutants were produced by heterologous expression in bacteria on a large scale in soluble fraction and purified in three stages. By dynamic light scattering (DLS) analysis, it was possible to observe a shift from the tetrameric to the filamentous form of the wild-type protein upon addition of Pi, while mutants remained in their initial state under the same conditions. Enzymatic efficiency was confirmed by kinetic assays based on a coupled reaction, tracking the absorbance of 340 nm wavelength light by NADH formed during the conversion of glutamate into α- ketoglutarate by the enzyme glutamate dehydrogenase (GDH). Analysis showed that the mutants also show reduced efficiency in contrast to the wild-type protein even in the presence of Pi. Thus, the data suggest that mutations that prevent filamentation are also responsible for inactivating the protein, confirming that substituted residues are critical for the formation, stabilization, and function of fGAC. We propose a mechanism for the transition from inactive dimers to hyper-active fGAC; understanding this process could establish the enzyme Glutaminase C as a promising molecular target for the development of new anti-tumor therapies.

As demandas energéticas e biossintéticas no câncer estão relacionadas à alteração de muitas vias na célula. Uma das principais mudanças ocorre na glutaminólise; a glutamina é um dos nutrientes essenciais para o metabolismo tumoral e é convertida em glutamato pelas enzimas glutaminases, codificadas em mamíferos por dois genes distintos, GLS e GLS2. Entre as isoformas existentes, a Glutaminase C (GAC) é crucial e encontrada em abundância em diferentes linhagens tumorais. Ela pode ser encontrada em diferentes estados oligoméricos com eficiência variável, e o tipo mais ativo é caracterizado pela formação de filamentos helicoidais (fGAC) na presença de fosfato inorgânico (Pi). No entanto, o mecanismo molecular pelo qual ocorre a oligomerização e o aumento de atividade ainda é desconhecido. Portanto, este projeto tem como objetivo discutir um novo modelo proposto pelo nosso grupo por meio da combinação de estudos de criomicroscopia eletrônica (cryo-EM) e bioquímicos da proteína selvagem ou modificada. Para isso, foi realizada mutagênese sítio-dirigida em resíduos de regiões da interface de interação sugerida e do loop de ativação. A GAC selvagem de camundongo e mutantes foram produzidas por expressão heteróloga em sistema bacteriano em grande escala na fração solúvel e purificadas em três etapas. Por meio da análise por espalhamento dinâmico de luz (DLS), foi possível observar uma transição da forma tetramérica para a forma filamentosa da proteína selvagem após a adição de Pi, enquanto as mutantes permaneceram em seu estado inicial sob as mesmas condições. A eficiência enzimática foi confirmada por ensaios cinéticos baseados em uma reação acoplada, acompanhando a absorbância de luz de comprimento de onda de 340 nm pelo NADH formado durante a conversão de glutamato em α-cetoglutarato pela enzima glutamato desidrogenase (GDH). A análise mostrou que os mutantes também apresentam eficiência reduzida em contraste com a proteína selvagem, mesmo na presença de Pi. Assim, os dados sugerem que as mutações que impedem a formação de filamentos também são responsáveis pela inativação da proteína, confirmando que os resíduos substituídos são críticos para a formação, estabilização e função de fGAC. Propomos um mecanismo para a transição de dímeros inativos para fGAC hiperativos; entender esse processo poderia estabelecer a enzima Glutaminase C como um alvo molecular promissor para o desenvolvimento de novas terapias antitumorais