The de novo synthesis of vitamin B6 (pyridoxal 5-phosphate) is conserved in most organisms but mammals. The synthesis of pyridoxal 5-phosphate (PLP) is carried out by a complex of two enzymes: Pdx1 and Pdx2. Pdx2 has glutaminase activity and transfers an ammonia molecule to Pdx1, which then utilizes ammonia, ribose 5-phosphate (R5P), and glyceraldehyde 3-phosphate (G3P) to synthesize PLP. There is no data of this pathway in Staphylococcus aureus, an opportunist pathogen of extreme concern. Hence, we propose investigating biochemical and structurally the bacterial Staphylococcus aureus PLP (SaPLP) synthase complex (SaPdx1- SaPdx2 complex) to bring light to its application as a potential target for antibiotics development. Therefore, the enzymes were expressed in Escherichia coli BL21 CodonPlus (DE3) RIL and purified through Ni-affinity chromatography, followed by TEV (Tobacco Etch Virus protease) cleavage and size exclusion chromatography (SEC). The oligomeric state of SaPdx1 in solution was analyzed using SEC-SAXS under three different conditions. The results revealed that the oligomerization of Pdx1 is dependent on salt concentration, reaching an equilibrium between dodecamers and hexamers under specific conditions. To better comprehend the biological significance of this phenomenon, SEC-MALS measurements were performed before and after the enzyme reaction. These experiments clarified that Pdx1 needs to assemble into a dodecamer to synthesize PLP. The crystallographic structure of SaPdx1 provided further insights, showing an ethylene glycol molecule bound to the active site, mimicking the substrate R5P interactions. Two monomers were found in asymmetric unit (ASU), but macromolecular interface analysis indicated that the dodecamer was the most probable quaternary structure. Regarding the SaPLP synthase complex, a mutation was introduced into SaPdx2, since it was described in literature that this mutation is related with the oligomerization of the PLP synthase complex. When examining the stability of the SaPLP synthase complex (wild type and mutant) through SEC-MALS and crystallographic structures, it was observed that the interaction in the wild type complex is transient and only fully saturated during catalysis. In contrast, the mutant complex exhibited greater stability, as expected. Kinetic assays revealed that the SaPLP synthase complex is more efficient than SaPdx1 when using alternative ammonia sources, evidencing the importance of SaPdx2 to the catalysis. For the first time, an inhibitory effect of high concentrations of G3P was observed, impacting SaPdx1 more than the complex. The three-dimensional structure of SaPdx1-2_mut supports the hypothesis that the PLP synthase complex is fully occupied by glutaminase subunits through Pdx2 inactivation. Collectively, our data offer new insights to understand this complex pathway and provide valuable information for exploration in the field of drug discovery.

A via de síntese de novo da vitamina B6 (piridoxal 5-fosfato) é conservada na maioria dos organismos exceto em mamíferos. A síntese de piridoxal 5-fosfato (PLP) é realizada por um complexo de duas enzimas: Pdx1 e Pdx2. A enzima Pdx2 possui atividade glutaminase e transfere uma molécula de amônia para Pdx1, que utiliza amônia, ribose 5-fosfato (R5P) e gliceraldeído 3-fosfato (G3P) para sintetizar o PLP. Não há dados dessa via em Staphylococcus aureus, um patógeno oportunista de extrema preocupação. Deste modo, propomos investigar bioquimicamente e estruturalmente o complexo SaPLP (SaPdx1-SaPdx2) sintase e fornecer um melhor entendimento dessa via como um possível alvo para o desenvolvimento de antibióticos. Para isso, as enzimas foram expressas em Escherichia coli BL21 CodonPlus (DE3) RIL e purificadas por cromatografia de afinidade a níquel, seguida de clivagem por TEV e cromatografia de exclusão molecular (SEC). O estado oligomérico de SaPdx1 em solução foi analisado por SEC-SAXS em três condições diferentes. Os resultados revelaram que a oligomerização de Pdx1 é dependente da concentração de sal e há um equilíbrio entre dodecâmeros e hexâmetros em condições específicas. Para compreender o significado biológico desse fenômeno, foram realizadas medidas de SEC-MALS antes e após a atividade. Esses experimentos esclareceram que Pdx1 precisa se associar a um dodecâmero para sintetizar PLP. Na estrutura cristalográfica de SaPdx1 uma molécula de etilenoglicol foi encontrada ligada ao sítio ativo, mimetizando as interações do substrato R5P. Na unidade assimétrica (ASU), foram encontrados dois monômeros, mas análises das interfaces entre macromoléculas indicaram que o dodecâmero é a conformação mais provável. Com relação ao complexo SaPLP, uma mutação foi feita na proteína SaPdx2, pois foi descrito na literatura que essa mutação está relacionada com a oligomerização do complexo PLP sintase. A estabilidade do complexo SaPLP nativo e mutante foi verificada por SEC-MALS e pelas estruturas cristalográficas. Observou-se que a interação do complexo nativo é transitória e só é saturado durante a catálise. Como esperado, o complexo mutante exibiu maior estabilidade. Ensaios cinéticos revelaram que o complexo SaPLP é mais eficiente do que a enzima SaPdx1 na presença de fontes alternativas de amônia, evidenciando a importância da enzima SaPdx2 para a catálise. Além disso, pela primeira vez, foi observado um efeito inibitório em altas concentrações de G3P, afetando mais a SaPdx1 do que o complexo. A estrutura cristalográfica de SaPdx1-2_mut corrobora a hipótese de que o complexo é totalmente ocupado pelas glutaminases por meio da inativação da Pdx2. Em suma, nossos dados oferecem novas perspectivas para entender essa via complexa e fornecem informações valiosas para o desenvolvimento de novos antibióticos.