O vírus Zika (ZIKV) é um membro da família Flaviviridae que teve a primeira ocorrência relatada no Brasil em abril de 2015. O maior impacto do ZIKV ocorreu devido a sua associação com o aumento no número de casos de microcefalia em bebês e fetos de gestantes infectadas com o vírus durante a epidemia que ocorreu no Brasil entre 2015 e 2016. Desde então, mais de 240.000 casos de febre Zika foram notificados no país, sendo 10.768 casos registrados no ano de 2019 e 6.705 casos prováveis no ano de 2020. Diante desses fatos, muitos estudos encontram-se em andamento para a busca de candidatos a fármacos eficazes contra o ZIKV. Dentre as proteínas não estruturais, a NS5 desperta grande interesse como alvo farmacológico, devido a já existir um inibidor de NS5 domínio RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) aprovado para uso clínico contra o vírus da Hepatite C. A RdRp é responsável pela síntese de RNA de novo, ou seja, sem a necessidade de um primer para o início da síntese. Promove a elongação do RNA viral, através da polimerização fazendo o uso de NTPs, garantindo assim a replicação viral. A inibição de qualquer uma dessas funções acarretaria o impedimento da replicação viral. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi obter a proteína NS5 do ZIKV domínio RdRp a fim de determinar a sua estrutura tridimensional por cristalografia de raios X, seguida da descoberta de inibidores. Para isso, planejamos duas construções para a proteína NS5 RdRp: a RdRp_truncada e a RdRp_integral. Com a RdRp_truncada foi possível obter cristais que produziram difração de raios X, o que possibilitou a resolução da estrutura cristalográfica da NS5 domínio RdRp a 1.9 Å. Essa estrutura foi utilizada para realizar a triagem computacional de inibidores, assim como ensaios biofísicos para a busca de possíveis ligantes. Com a RdRp_integral, foi possível a padronização de um ensaio baseado no marcador fluorescente de ácido nucleico SYBR Green I, que monitora a atividade da proteína em tempo real, e que foi utilizado na busca por inibidores em larga escala. Foi possível triar a inibição de mais de 500 compostos, incluindo a biblioteca de compostos drug-like da Pandemic Response Box (Medicines for Malaria Venture - MMV) (PRB), e os compostos sintéticos e provenientes de produtos naturais que foram encontrados por triagem biofísica e virtual. Ao todo, foram identificados 17 potenciais inibidores da NS5 RdRp, sendo que 9 deles apresentaram inibição na faixa micromolar (IC50 ≤10 μM) e 5 deles apresentaram inibição na faixa nanomolar (IC50 ≤ 1 μM). Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que, apesar da ausência de estruturas cristalográficas complexadas com ligantes, foi possível encontrar moléculas com alta inibição, que podem ter sua ação otimizada por ensaios computacionais e posteriormente testadas contra a RdRp. Dentre elas, os compostos provenientes de produtos naturais que se mostraram extremamente interessantes, em especial os derivados do anel flavonol, que se mostram potentes na inibição da atividade da RdRp.

The Zika virus (ZIKV) is a member of the Flaviviridae family that was first reported in Brazil in April 2015. The major impact of ZIKV was due to its association with the increase in the number of microcephaly cases reported in newborns of pregnant women infected with the virus during the epidemic that occurred in Brazil between 2015 and 2016. Since then, more than 240.000 cases of Zika fever have been reported in the country, with 10.768 cases registered in 2019 and 6.705 probable cases in 2020. Given these facts, many studies are underway to search for candidates for effective drugs against ZIKV. Among the ZIKV non-structural proteins, NS5 is of great interest as a pharmacological target, due to the existence of an inhibitor approved for clinical use against the Hepatitis C virus NS5 RNA-dependent RNA polymerase domain (RdRp). RdRp is responsible for the de novo synthesis of viral RNA, that is, without the need for a primer to start the synthesis. It promotes the elongation of viral RNA, through polymerization using NTPs, thus guaranteeing viral replication. Inhibition of any of these functions would prevent viral replication. In this context, the objective of this project was to obtain the NS5 RdRp domain from the ZIKV in order to determine its three-dimensional structure by X-ray crystallography, followed by the discovery of inhibitors. For this purpose, we designed two constructions for the NS5 RdRp protein: the RdRp_truncated and the RdRp_integral. With the RdRp_truncated, it was possible to obtain crystals that produced X-ray diffraction, which enabled the elucidation of the crystallographic structure of the NS5 RdRp domain at 1.9 Å resolution. This structure was used to perform a computational screening of inhibitors as well as biophysical assays to search for possible ligands. With RdRp_integral, it was possible to standardize an assay based on the fluorescent nucleic acid marker SYBR Green I, which monitors the activity of the protein in real time, and which was used in the extended search for inhibitors. It was possible to test the inhibition of more than 500 compounds, including the drug-like compound library Pandemic Response Box (PRB, Medicines for Malaria Venture - MMV), as well as synthetic compounds and natural products that were previously identified by biophysical methods and virtual screening. In all, 17 potential NS5 RdRp inhibitors were identified, with 9 of them showing inhibition in the micromolar range (IC₅₀ ≤10 μM) and 5 of them showing inhibition in the nanomolar range (IC₅₀ ≤1 μM). The results obtained in this work demonstrate that despite the absence of crystallographic structures complexed with ligands, it was possible to find molecules with high inhibition, which can have their action optimized by computational approaches and subsequently tested against the ZIKV NS5 RdRp. Among them, the natural products that have shown good RdRp inhibitory activity seem to be very promising for further studies, particularly those derived from the flavonol ring.