O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, um insumo industrial versátil e de alta demanda, tendo em vista a importância de seus subprodutos, como o açúcar e o etanol. O bagaço de cana-de-açúcar é o principal rejeito agroindustrial do processamento desse insumo e rotas biotecnológicas de valorização desse material lignocelulósico estão sendo cada vez mais aprimoradas para a obtenção de produtos de alto valor agregado, como xilooligossacarídeos (XOS) pré-bióticos, que são produzidos por meio da hidrólise do arabinoxilano. Este trabalho apresenta a caracterização bioquímica detalhada de uma arabinofuranosidase de Bifidobacterium longum pertencente à família GH43 (BlAbf43), em que se observou pH ótimo de 6,0 em um perfil restrito e temperatura ótima de 55 ºC, com atividade mais elevada na faixa de 35-60 ºC. O teste de estabilidade térmica da enzima mostrou meia-vida de 7,5 minutos na temperatura ótima, em contraste com 110 minutos a 45 ºC. Os ensaios cinéticos mostraram maior afinidade e maior eficiência da enzima por arabinoxilano de trigo que por pNP-α-L-arabinofuranosídeo (k_M de 1,60 μM e de 1,5 mM, respectivamente e k_cat/k_M de 0,67 s^-1 μM^-1 e de 31 s^-1 mM^-1, respectivamente). Os ensaios de sinergismo de BlAbf43 com xilanases em arabinoxilano de trigo mostrou grau de sinergismo de 1,35 quando combinada com xilanase da família GH10 equitativamente e de 1,7 quando combinada com xilanase da família GH11 em proporção de 10 para 30 miliunidades (xilanase para arabinofuranosidase). BlAbf43 possibilitou também aumento nos rendimentos de XOS produzidos a partir de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado, além de aumentar a proporção de XOS curtos nos hidrolisados, que possuem efeito pré-biótico mais destacado. A análise de perfil de clivagem de arabinofuranosil-xilooligossacarídeos (AXOS) e de XOS lineares pela enzima, utilizando cromatografia de troca aniônica de alta performance, comprovou que BlAbf43 é um módulo multifuncional, apresentando também atividades xilobiohidrolase e xilosidase, pois foi capaz de produzir xilose a partir de A2XX e xilobiose a partir de XOS lineares. O estudo do modelo estrutural da enzima e os resultados de docking molecular revelaram que BlAbf43 apresenta um bolso catalítico capaz de acomodar uma única molécula de arabinofuranose que esteja substituída na unidade terminal de xilose em AXOS, além disso, uma molécula de xilopiranose também pode ser acomodada em tal bolso, provocando a flexão da molécula de XOS lineares e consequente hidrólise, levantando hipóteses para as bases moleculares da multifuncionalidade dessa enzima. Este estudo demonstra o potencial biotecnológico dessa ferramenta enzimática para incremento nos rendimentos de XOS pré-bióticos, além de elucidar os mecanismos de sinergismo com xilanases para desconstrução do arabinoxilano de cana-de-açúcar e os fundamentos estruturais de sua atividade múltipla.

Brazil is the global largest sugarcane producer, an industrially versatile feedstock that is high demanded due to the importance of its byproducts, which include sugar and ethanol. The bagasse is an ubiquitous residue of sugarcane processing and biotechnological routes for valorization of this lignocellulosic material helps solving storage problems and obtaining value-added products, such as prebiotic xylooligosaccharides (XOS), which are produced through arabinoxylan hydrolysis. This work presents detailed biochemical characterization of an arabinofuranosidase from Bifidobacterium longum, belonging to GH43 family (BlAbf43), which presented optimum pH of 6.0 in a narrow profile and optimum temperature of 55 ºC, with higher activity in the range of 35-60 ºC. Thermal stability test showed that enzyme half-life was 7,5 minutes at optimum temperature, contrasting with 110 minutes at 45. Kinetic assays showed higher affinity and efficiency of the enzyme towards wheat arabinoxylan than pNP-α-L-arabinofuranoside (K_m of 1,60 μM and 1.5 mM, respectively and k_cat/kM of 0.67 s^-1 M^-1 and 31 s^-1 mM^-1, respectively). BlAbf43 synergy assays using wheat arabinoxylan showed degree of synergism of up to 1.35 when equally combined to GH10 xylanase and up to 1.7 when combined to GH11 xylanase in 10:30 enzymatic unit ratio (xylanase to arabinofuranosidase). The use of BlAbf43 also caused increase in XOS yields from pretreated sugarcane bagasse, as well as a shift in XOS profile towards shorter XOS, which present enhanced prebiotic activity. Enzyme cleavage pattern of arabinofuranosyl-xylooligosaccharides (AXOS) and linear XOS, assessed through high performance anion exchange chromatography, confirmed that BlAbf43 is a multifunctional module, also presenting xylobiohydrolase and xylosidase activities, since it was able to produce xylose from A2XX and xylobiose from linear XOS. Analysis of the structural model and molecular docking results showed that BlAbf43 presents a catalytic pocket that can accommodate a single arabinofuranose molecule which must be substituted in the terminal xylose unit in AXOS, furthermore, a xylopyranose molecule can also occupy the pocket volume, causing the linear XOS molecule to flex and consequently hydrolyze, which helps gaining insights on the molecular basis for enzyme multifunctionality. This study demonstrates the biotechnological potential of this enzymatic tool to enhance prebiotic XOS yields, while also sheds light on the synergy mechanisms with xylanases for sugarcane arabinoxylan deconstruction and the structural fundamentals of its multiple activities.