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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.76.2020.tde-29092020-142751
Documento
Autor
Nome completo
Naiara Utimura Torres
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Carlos, 2020
Orientador
Banca examinadora
Guido, Rafael Victório Carvalho (Presidente)
Araujo, Ana Paula Ulian de
Mui, Tsai Siu
Pereira, Gonçalo Amarante Guimarães
Trivella, Daniela Barretto Barbosa
Título em português
Investigação das metodologias de produção de Taq DNA polimerase Hot Start e suas implicações na atividade da enzima
Palavras-chave em português
Hot Start
PCR
Taq DNA polimerase
Resumo em português
A reação de polimerização em cadeia (PCR, do inglês, Polymerase Chain Reaction) é um método amplamente usado em laboratórios de biologia molecular, análise forense, diagnóstico clínico e controle de qualidade em indústrias alimentícias. Taq DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq) é a enzima mais amplamente usada na PCR por sintetizar DNAs de diversos tamanho e natureza, além de manter sua atividade em diferentes meios reacionais. Apesar disso, essa enzima pode apresentar amplificações inespecíficas e formação de dímeros de oligonucleotídeos devido a sua atividade residual em temperatura ambiente, na qual a maioria das reações é preparada. Para solucionar esse problema, foram desenvolvidas Taqs que são ativadas somente após uma incubação em alta temperatura (do inglês, Hot Start Taq DNA polymerase). Essas enzimas são, usualmente, ligadas a biomoléculas ou grupamentos químicos que impedem a sua atividade a temperatura ambiente. Com a incubação em altas temperaturas, ou ciclo Hot Start, as biomoléculas e grupamentos químicos se desligam da polimerase, que recupera a sua atividade. Apesar de muito utilizada, apenas um único tipo de Taq Hot Start é produzida no Brasil, fazendo com que o valor e a disponibilidade dessa enzima sejam variados. Dessa forma, esse trabalho realizado em colaboração com a empresa Cellco Biotec do Brasil LTDA visou à produção de Taq Hot Start de alta qualidade por técnicas de mutagênese, ligação a anticorpo/aptâmero, reação com grupamentos químicos e precipitação de íons divalentes do meio reacional. Para isso, Taq foi produzida heterologamente em Escherichia coli e teve sua purificação otimizada através de quatro etapas cromatográficas. Visando avaliar a atividade enzimática, um método de determinação de unidades enzimáticas sem radioisótopos foi desenvolvido, baseado na fluorescência de uma molécula intercalante de DNA. Para a produção das Taqs Hot Start por ligação a aptâmero e anticorpo, diversas concentrações dessas biomoléculas inibidoras foram misturadas à enzima nativa, que teve sua atividade a 25 ºC avaliada em um termociclador de tempo real. Na versão Hot Start por modificação química, derivados de anidrido maleico foram ligados covalentemente à enzima, em diversas proporções molares. Já no tampão Hot Start, foram testados agentes tamponantes com base em íons fostato que promoveriam a precipitação do cofator enzimático Mg+2. Após a otimização de cada metodologia, todas as DNA polimerases Hot Start foram comparadas em eficiência, sensibilidade, baixa atividade a 25 ºC, amplificação de fragmentos de DNA com alta porcentagem de GC, amplificações complexas, desempenho em PCR multiplex e custo de produção. Diferente do esperado, a enzima mutante apresentou atividade residual a 25 ºC. Por outro lado, as estratégias de ligação de anticorpo e modificação química foram as que apresentaram o melhor desempenho na obtenção de enzimas Hot Start. Dessa forma, foi iniciada a produção de Taq DNA polimerases Hot Start nacionais de alta qualidade por meio da ligação de anticorpos e grupos químicos que apresentaram desempenhos iguais ou superiores às enzimas importadas. Esses resultados indicam a capacidade de produção local de novos produtos biotecnológicos de alto valor agregado para o mercado nacional e internacional, posicionando o Brasil entre os países detentores dessa tecnologia.
Título em inglês
Investigation of production methodologies of Taq DNA polymerase Hot Start and its implications in the enzyme activity
Palavras-chave em inglês
Hot Start
PCR
Taq DNA polymerase
Resumo em inglês
Polymerase Chain Reaction (PCR) is a common method used in molecular biology laboratories, forensic analyses, clinic diagnostics and quality control in food industries. Taq DNA polymerase from Thermus aquaticus is widely used in PCRs because of its unique features, including the ability to synthesize DNAs of different sizes and nature and to maintain its activity in many reaction mixes. Even though, this enzyme may unspecifically amplify DNA regions or primer dimers due to the residual activity at room temperature, in which most of reactions are prepared. To tackle this limitation, Taq DNA polymerases that are activated at high temperatures (Hot Start cycle) have been developed. These enzymes are frequently bound to biomolecules or chemical groups that prevent the activity at room temperature. After the Hot Start cycle, the biomolecules or chemical groups are released from the polymerase which recovers the activity. In Brazil, there is only one producer of Taq DNA polymerase Hot Start, because of that, prices and availability of the enzyme may vary. This work was conducted in collaboration with Cellco Biotec do Brasil LTDA and aimed at producing high quality Taq DNA polymerase Hot Start based on techniques such as mutagenesis, antibody/aptamer binding, chemical modification and precipitation of magnesium ions from reaction buffer. In this sense, Taq DNA polymerase was heterologously expressed in Escherichia coli and purified with four chromatographic steps. To verify the enzymatic activity, we developed a radioisotope-free methodology to determine polymerases units based on fluorescence of a DNA intercalator. To produce Taq DNA polymerase Hot Start by aptamer or antibody binding, several concentrations of those inactivator biomolecules were added into the purified enzyme, which had its activity measured at 25 ºC in a real-time thermocycler. Chemically modified Hot Start were produced incubating the purified enzyme with maleic anhydride derivatives that bound covalently to the enzyme. For the Hot Start buffer, we used buffers containing phosphate ions that promote magnesium precipitation. After optimization of each methodology, DNA polymerases were compared in efficiency, sensibility, activity at 25 °C, amplification of CG-rich DNAs, complex amplification, performance in multiplex PCR and production costs. Different from expected, we did not observe a lower enzymatic activity at 25 °C on the mutant enzyme. On the other hand, the strategies based on antibodies and aptamers or chemical modification were successful in delivering Hot Start enzymes. Based on that, the production of national Taq DNA polymerases Hot Start bound to antibodies and chemically modified enzyme was started. The enzymes show similar or superior performance related to other commercial enzymes. These results indicate the capacity of the local production of new value-added biotechnological products for the national and international market, which place Brazil among the countries with this technology.
 
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Data de Publicação
2020-10-14
 
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