A Tripanossomíase Humana Africana (Human African Trypanosomiasis, HAT), popularmente conhecida como Doença do Sono, é causada por um protozoário extracelular pertencente ao gênero Trypanosoma presente no continente africano. Apesar dos avanços no controle e tratamento da doença, o estudo dos tripanossomatídeos é interessante, pois esses organismos possuem mecanismos bioquímicos únicos e conservados entre si como a transcrição policistrônica e processamento da maioria do seu pré-RNA mensageiro por trans-splicing, que podem ser usados de modelo para o estudo de outros tripanossomatídeos. O splicing é o processo de retirada de regiões não codificantes do gene dos eucariotos, chamadas de íntrons, e subsequente ligação das regiões codificantes, os éxos. O splicing pode ocorrer de duas formar cis-splicing e trans-splicing. Tanto no cis quanto no trans-splicing, as reações de transesterificação são catalisadas pelo spliceossomo, uma maquinaria dinâmica que se rearranja em cada passo da reação através da interação ordenada de cinco ribonucleoproteínas (small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs) denominadas U1, U2, U4/U6 e U5 e inúmeros fatores não snRNPs. Esses complexos são compostos de pequenos RNAs ricos em uridina (U snRNAs) ligados a proteínas específicas de cada snRNP e proteínas comuns a todas as snRNPs (proteínas Sm). Esse trabalho tem como objetivo o estudo de duas proteínas específicas de U5 snRNP, U5-102K e U5-15K, bem como de uma helicase relacionada à liberação dos produtos do splicing, a Prp43. A U5-102K é formada por 44 hélices-α sendo 36 organizadas nas repetições chamadas TRPs. Essa proteína é essencial para a formação do tri-snRNP U5.U4/U6. Já a U5-15K possui uma estrutura semelhante a de uma tiorredoxina e tem uma localização central no tri snRNP U5.U4/U6, participando da estabilização do U6 snRNA e sua saída do spliceossomo pode estar relacionada à ativação de um dos complexos formados na durante a reação. A Prp43 é uma proteína da família DEAH-box e participa dos passos finais do processo de splicing, atuando na liberação do íntron excisado. Esse trabalho teve como objetivo a caracterização da atividade de autoclivagem da U5-15K, o estudo de sua estrutura terciária, interação com a U5-102K e a identificação dos parceiros de interação da U5-102K e da Prp43. Foram realizadas mutações sítio dirigidas na sequência da U5-15K, na cisteína 66 e em 4 serinas do C-terminal e os resultados mostram que o resíduo catalítico da autoclivagem seja a Ser 126 e o ponto de clivagem a Ala 142 e sugerem que a atividade pode ocorrer quando a proteína faz parte do complexo B. Os testes de cristalização usando a U5-15K sem alça e a U5-15K S126A, resultaram em pequenos cristais para a segunda proteína. Para a interação entre U5-15K e U5-102K foi expresso o N-terminal da U5-102K, região onde a interação das duas proteínas ocorre em humanos e levedura, e sinais da interação foram vistos com uso da técnica de DLS. A purificação dos parceiros de interação da U5-102K não resultou em novas proteínas identificadas. Os experimentos com a Prp43 resultaram na identificação de uma proteína homóloga à NtrI, que em humanos e levedura, faz a ativação da atividade da Prp43.

Human African Trypanosomoasis (HAT), commonly known as Sleeping Sickness, is caused by an extracellular protozoan belonging to the genus Trypanosoma spread through African continent. Despite the advances regarding control and treatment of the disease, the studies of trypanisomatids is of interest because of their unique and conserved biochemical mechanisms such as polycistronic transcription and processing of the majority of their pre-mRNA through trans-splicing that can be used to study other trypanosomatides. Splicing is the process of removal of non-coding regions of eucariotic gens, called introns, and subsequent linking of the coding regions, called exons. Splicing may occur in to ways cis-splicing and trans-splicing. Both in cis and trans-splicing the transesterification reactions are catalyzed by the spliceosomo, a dynamic machinery that rearranges itself in each reaction step through ordered interactions of five small nuclear ribonucleoproteins (snRNP) called U1, U2, U4/U6 e U5 and non snRNP factors. These complexes are composed by small RNAs riches in uridine (U snRNAs) bounded to snRNPs specific proteins and proteins common to all snRNPs (Sm proteins). This research aims the study of two U5 snRNP specific proteins, U5-102K e U5-15K, as well as the helicase associated to the release of splicing products, Prp43. U5-102K is composed by 44 α-helixes, 36 of which are organized by repetitions called TRPs. This protein is essential to tri-snRNP U5.U4/U6 assembly. U5-15K has a tioredoxin like structure and locates itself in a central position of tri-snRNP U5.U4/U6, participating in U6 snRNA stabilization and its exit may be associated to the activation of a complex formed during the reaction. Prp43 is a protein from DEAH-box family and participates in the final steps of splicing. The objectives of this research where the characterization of U5-15K self-cleavage activity, study of its tertiary structure, study of the interaction between U5-15K and U5-102K and the identification of U5-102K and Prp43 partners. Site-directed mutations were performed at U5-15Ks cistein 66 and the 4 serines closest to the C-terminus, the results showed that its self-cleavage catalytic residue is the Ser 126 and its cleavage site the Ala 142 and suggest that this activity can occur when the protein positions itself inside B complex. Crystallization tests were made using the truncated U5-15K and U5-15K S126A, what resulted in small crystals for the second protein. To perform the interaction experiments between U5-15K and U5-102K, the N-term of U5-102K, region where the interaction occurs in human and yeast, was used and the interaction observed using DLS. The purification of interaction partners using U5-102K as bait did not result in new identifications. The same experiment, using Prp43 as bait resulted in the identification of a protein homologous to human and yeast NtrI that activates Prp43 function on splicing.