Carboxilesterases compreendem uma grande classe com enovelamento α/β-hidrolase e catalisam a clivagem e a formação de ligações éster. São amplamente difundidas na natureza, sendo expressas por animais, plantas e microrganismos, desempenhando um papel essencial no metabolismo de ésteres carboxílicos endógenos e exógenos. Além das importantes funções fisiológicas, elas compõem alguns dos biocatalisadores mais importantes para setores da biotecnologia, sendo amplamente aplicados em diferentes processos industriais e com muitas preparações comerciais disponíveis. Além disso, B. licheniformis se apresenta como uma fonte promissora de carboxilesterases. No entanto, até o momento, não há informações estruturais sobre carboxilesterases deste organismo. Este estudo teve como objetivo analisar bioquímica e estruturalmente duas carboxilesterases de B. licheniformis, focando em características relevantes para aplicações biotecnológicas. BlEst1 apresentou maior atividade hidrolítica contra p-nitrofenil acetato, em pH 7,0 e a 40 ºC. Além disso, BlEst1 mostrou-se estável em alguns solventes orgânicos e estabilidade em altas concentrações de sal (0 – 3 M NaCl), enquanto mantem a atividade, com aumento significativo de 17 °C na temperatura de melting, revelando sua característica halotolerante. A análise estrutural revelou uma superfície eletrostática acídica, indicando que BlEst1 pode adotar o modelo de estabilização-solvatação, a teoria mais comum para a adaptação halofílica. BlEst2 apresentou um enovelamento típico de α/β-hidrolase e a presença de múltiplos domínios. O domínio catalítico apresentou duas inserções, que ocupam localizações conservadas que comumente constituem o domínio lid em lipases. Os domínios C-terminais compõem o propeptídeo de BlEst2 e sua remoção é necessária para a ativação enzimática. Além disso, eles agem como chaperonas intramoleculares, sendo necessários para o enovelamento adequado. Depois da ativação, o BlEst2 apresentou a maior atividade hidrolítica (292 U/mg) contra o p-nitrofenil butirato a pH 8,0 e 45 ºC. Para ambas as enzimas encontramos incoerências entre a classificação e dados experimentais, indicando que os sistemas de classificação ainda não são representativos o suficiente para explicar a grande diversidade dentro desse grupo de hidrolases.

Carboxylesterases comprise a major class of α/β-fold hydrolases and catalyze the cleavage and formation of ester bonds. They are widespread in nature, being expressed by animals, plants and microorganisms, and playing an essential role in the metabolism of the endogenous and exogenous carboxyl esters. Besides the important physiological functions, they compose one of the most important biocatalysts for biotechnology, being widely applied on a broad range of industrial applications and with many available commercial preparations. Moreover, B. licheniformis features a promising source of carboxylesterases. However, up to date, there is no structural information regarding carboxylesterases of this organism. This study aimed to analyze biochemically and structurally two B. licheniformis carboxylesterases, focusing on relevant features for biotechnological applications. BlEst1 presented the higher hydrolytic activity against p-nitrophenyl acetate at pH 7.0 and 40 ºC. Furthermore, BlEst1 showed to be stable in some organic solvent stability in high salt concentrations (0 – 3 M NaCl), while maintaining activity, with significantly increase of 17 °C on its melting temperature, revealing its halotolerant character. Structural analysis revealed an acidic electrostatic surface, indicating that BlEst1 may adopt the solvation-stabilization model, the most common theory for the halophilic adaptation. BlEst2 presented the core region with a typical α/β-hydrolase fold and an overall multidomain structure. The catalytic domain presented two insertions, which occupy conserved locations in α/β-hydrolase proteins and commonly made up the lid domain on lipases. The C-terminal domains compose the BlEst2 propeptide and their removal is required to enzyme activation. Besides this, they act like intramolecular chaperones, being required for properly folding. After activation, BlEst2 presented the higher hydrolytic activity against p-nitrophenyl butyrate (292 U/mg) at pH 8.0 and 45 ºC. For both enzymes, we found inconsistencies between classification and experimental data, indicating that the classification systems are not representative enough to explain the great diversity within this group of hydrolases.