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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.76.2020.tde-25082021-081412
Documento
Autor
Nome completo
Leonardo Delphito
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Carlos, 2020
Orientador
Banca examinadora
Navarro, Marcos Vicente de Albuquerque Salles (Presidente)
Lopes, José Luiz de Souza
Melo, Fernando Alves de
Título em português
Estudos bioquímicos e biofísicos das proteínas PA0575 e PA0285, componentes das vias de sinalização do c-di-GMP em Pseudomonas aeruginosa
Palavras-chave em português
Pseudomonas aeruginosa
c-di-GMP
GGDEF-EAL
Interação de proteínas
Resumo em português
O segundo mensageiro c-di-GMP orienta importantes respostas fisiológicas em bactérias como progressão do ciclo celular, expressão de fatores de virulência, formação de biofilme, entre outros. A sinalização geral desse segundo mensageiro tem início dado estímulos externos e/ou internos e envolve proteínas que sintetizam o c-di-GMP (DGC, diguanilato ciclases, possuem o domínio GGDEF) e proteínas que o degradam (PDE, fosfodiesterases, possuem o domínio EAL). Por sua vez, o c-di-GMP atua sobre diversos alvos moleculares e resulta em respostas fenotípicas específicas. As vias de sinalização do c-di-GMP envolvem uma multiplicidade de DGCs, PDEs e efetores que são acionados especificamente e seletivamente para culminar em uma resposta fisiológica específica. Ainda está em estudo como essas vias não interferem entre si, entretanto, alguns mecanismos já foram propostos, como o confinamento do sinal perto do efetor, efetores com diferentes afinidades ao c-di-GMP, interação proteína-proteína, que pode envolver a formação de redes hierárquicas de proteínas. Em um estudo de interação proteína-proteína por duplo híbrido com todas as DGCs e PDEs de Pseudomonas aeruginosa, nosso grupo revelou um intrincado mapa de interação entre proteínas, incluindo o par PA0575-PA0285. Essas duas proteínas são transmembranares e possuem uma arquitetura na porção citoplasmática composta por PAS-GGDEF-EAL. Com o objetivo de confirmar a interação detectada in vivo entre PA0575 e PA0285 (realizada com construções citosólicas inteiras) e compreender melhor o funcionamento dessas proteínas, diversas construções de PA0575 e PA0285 foram expressas em E. coli, e purificadas por cromatografias de afinidade e de exclusão molecular. Em ensaios de crosslinking químico e termoforese em microescala foi possível confirmar e mapear a interação direta entre os domínios GGDEF de PA0575 e EAL de PA0285, cuja constante de dissociação (Kd) é aproximadamente 40 μM. Análises do estado de oligomerização por SEC-MALS com as construções de PA0575 e com o EAL de PA0285 mostraram que os domínios GGDEF e EAL isolados, e GGDEF-EAL de PA0575 são majoritariamente monoméricos em solução, o mesmo foi observado para o EAL de PA0285. Enquanto as construções PAS-GGDEF e PAS-GGDEF-EAL de PA0575 se apresentaram majoritariamente diméricas, de acordo com a necessidade de dimerização via N-terminal do GGDEF. Observado nos ensaios de crosslinking químico a construção inteira citosólica de PA0285 mostrou muito baixa formação de dímeros. Para verificar as atividades DGC e PDE de PA0575 e PA0285, foram realizados ensaios para detecção dos produtos reacionais por HPLC. Em concordância com os resultados de estado oligomérico, as construções diméricas PAS- GGDEF e PAS-GGDEF-EAL de PA0575 apresentaram atividade DGC, decorrente da necessidade de dimerização para atividade, e da dimerização dependente do N-terminal dos GGDEF. Todas as construções de PA0575 e PA0285 contendo o domínio EAL apresentaram atividade PDE, uma vez que o c-di-GMP pode induzir a dimerização do EAL, estado necessário para a atividade PDE. Os resultados de interação entre PA0575 e PA0285, a atividade DGC de PA0575 e a atividade PDE de PA0285 apresentados nesse trabalho são inéditos. O estudo aqui apresentado contribuí para um melhor entendimento das proteínas com GGDEF-EAL, integrantes das vias de sinalização do importante mensageiro intracelular bacteriano c-di-GMP.
Título em inglês
Biochemical and biophysical studies of proteins PA0575 and PA0285, components of c-di-GMP signaling pathways in Pseudomonas aeruginosa
Palavras-chave em inglês
Pseudomonas aeruginosa
c-di-GMP
GGDEF-EAL
Protein-protein interaction
Resumo em inglês
The second messenger c-di-GMP guides important physiological responses in bacteria such as cell cycle progression, expression of virulence factors and biofilm formation, among others. The general signaling of this second messenger initiates from external and/or internal stimuli and involves proteins that synthesize c-di-GMP (DGC, diguanylate cyclases, which contains the GGDEF domain) and proteins that degrade it (PDE, phosphodiesterases, which contains the EAL domain). The c-di-GMP acts on several molecular targets and results in specific phenotypic responses. The c-di-GMP signaling pathways involve a multiplicity of DGCs, PDEs and effectors that are specifically and selectively triggered to culminate in a specific physiological response. It is still being studied how these pathways do not interfere with each other, however, some mechanisms have already been proposed, such as signal confinement close to the effector, effectors with different affinities to c-di-GMP, protein-protein interaction, which may involve the formation of hierarchical protein networks. In a study of protein-protein interaction by two-hybrid system with all DGCs and PDEs of Pseudomonas aeruginosa, our group revealed an intricate map of interaction protein-protein, including the PA0575-PA0285 pair. These two proteins are transmembrane and have an architecture in the cytoplasmic portion with of PAS-GGDEF-EAL. In order to confirm the interaction detected in vivo between PA0575 and PA0285 (performed with whole cytosolic constructions) and to better understand the functioning of these proteins, several constructs of PA0575 and PA0285 were expressed in E. coli and purified by affinity and size-exclusion chromatographies. In chemical crosslinking assays and microscale thermophoresis, it was possible to confirm and map the direct interaction between the GGDEF domains of PA0575 and EAL of PA0285, with dissociation constant (Kd) of approximately 40 μM. Analysis of the oligomerization states by SEC-MALS with the PA0575 constructs and with the PA0285 EAL showed that the isolated GGDEF and EAL domains, and GGDEF-EAL of the PA0575 are mostly monomeric in solution, the same was observed for PA0285-EAL. While the constructions PAS-GGDEF and PAS-GGDEF-EAL of PA0575 were mostly dimeric, according to the need for dimerization via N-terminal GGDEF domains. Observed in chemical crosslinking assays the entire cytosolic construction of PA0285 showed very low formation of dimers. To verify the DGC and PDE activities of PA0575 and PA0285, analyzes of the product of the enzymatic reaction by hplc were performed. In agreement with the results of oligomeric state, the dimeric constructions PAS-GGDEF and PAS-GGDEF-EAL of PA0575 displayed DGC activity, due to the need for dimerization for activity and the N-terminal dependent dimerization of the GGDEF domains. All PA0575 and PA0285 constructs containing the EAL domain displayed PDE activity, since c-di-GMP can induce EAL dimerization, a necessary condition for PDE activity. The results of interaction between PA0575 and PA0285, DGC activity of PA0575 and the PDE activity of PA0285 presented in this study are unprecedented. This study contributes to a better understanding of proteins with GGDEF-EAL, which are part of the signaling pathways of the important bacterial intracellular messenger c-di-GMP.
 
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Data de Publicação
2021-08-31
 
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