O desenvolvimento de enzimas que apresentam maior estabilidade térmica pode tornar o processo de hidrólise de biomassa mais econômico pelo aumento na taxa de hidrólise, diminuição da contaminação dos reatores e maior transferência de massa pela redução da viscosidade do meio. Dessa forma, foram conduzidos experimentos para prospecção e detecção de proteínas presentes no secretoma do fungo termofílico Thermothielavioides terrestris cultivado em diferentes fontes de carbono: bagaço de cana-de-açúcar in natura (SCBIN), explodido à vapor (SCBSE) e polpa Kraft branqueada de eucalipto (BEKP), utilizando a técnica de LC-MS/MS. As análises mostraram uma hidrolase de glicosídeo da família 3 (GH3) como a maior constituinte do secretoma em BEKP e uma GH7 contendo módulo de ligação ao carboidrato da família 1 para SCBSE e SCBIN. O conteúdo proteico em SCBIN mostrou um repertório de hemicelulases que representaram 8% do total da contagem de espectros normalizados em comparação a 4% em BEKP e SCBSE, refletindo o efeito da composição da biomassa na regulação das proteínas secretadas. As análises também revelaram a presença de mecanismos oxidativos na degradação da biomassa. A primeira componente da análise de PCA das CAZymes revelou que SCBSE e SCBIN são correlacionados negativamente e que o SCBSE é caracterizado pela intensa remodelagem da parede celular, o que parece estar relacionado a intensa atividade secretória, indicando que o SCBSE possui potencial como meio de autoindução. Em contrapartida, retem muitas enzimas adsorvidas, o que pode ser não produtivo como matéria-prima para obtenção de monossacarídeos. A análise estatística apontou as enzimas diferencialmente secretadas no secretoma e que foram escolhidas para expressão heteróloga. As enzimas TtCel7.2 e TtCel7.3 secretadas em fungo filamentoso e as enzimas TtXil43, TtAraf54, Tex e TtGal5 expressas em bactéria exibiram temperatura ótima acima de 50 ºC e pH ligeiramente ácido. TtCel7.2 e TtCel7.3 exibiram diferenças de atividade e estabilidade térmica com 80% de atividade após 3 horas de incubação à 65 ºC.

The development of enzymes that present higher thermal stability, reduce the chances of reactor contamination, increase the hydrolysis rate and intensify the mass transfer by decreasing the viscosity of the medium, favoring a more economical process. Thus, experiments were conducted for the prospecting and detection of proteins present in the secretome of thermophilic fungus Thermothielavioides terrestris grown in different carbon sources, such as sugarcane bagasse in natura (SCBIN), sugarcane bagasse steam exploded (SCBSE) and bleached eucalyptus Kraft pulp (BEKP) using the LC-MS/MS technique. Analyzes showed one glycoside hydrolase of family 3 (GH3) as the major constituent of the BEKP secretome and one GH7 containing CBM1 in SCBSE and SCBIN. The protein content of the SCBIN condition showed a broad range of hemicellulases, that representing 8% of the total normalized spectra count (NTSC) compared to 4% in BEKP and SCBSE, it reflecting the effect of biomass composition on the regulation of secreted proteins. The analyzes also revealed a proportional content of cellulases and auxiliary activities (AAs), what reveal the presence of oxidative mechanisms in this microorganism during biomass degradation. The first component of PCA analysis of CAZymes revealed that SCBSE and SCBIN are negatively correlated and that SCBSE is characterized by intense cell wall remodeling, which appears to be related to intense secretory activity, indicating that SCBSE has potential as an auto induction media for CAZymes. Statistical analysis indicated the enzymes differentially expressed in the secretoma and that were chosen for heterologous expression later. TtCel7.2 and TtCel7.3 enzymes expressed in filamentous fungus and TtXil43, TtAraf54, Tex and TtGal5 enzymes expressed in bacteria exhibited optimum temperature above 50 ° C and slightly acidic optimum pH. TtCel7.2 and TtCel7.3 exhibited differences in activity and thermal stability with 80% residual activity after 3 hours of incubation at 65 ° C.