A replicação do material genético é essencial para a manutenção e propagação da vida. No caso do DNA em eucariotos, esse processo se inicia pelo Complexo Pré- Replicação (pre-RC). Para sua formação, ocorre o reconhecimento de Origens de Replicação (ORIs) no genoma pelo ORC_1-6, seguido da ligação aos fatores de licenciamento CDC6 e CDT1 e recrutamento da helicase MCM_2-7. O parasita responsável pela doença de Chagas Trypanosoma cruzi apresenta apenas ORC1 do hexâmero de reconhecimento de ORI e essa proteína é intimamente relacionada em sequência a CDC6. A predição da estrutura de TcORC1/CDC6 por diferentes métodos computacionais, seu estudo filogenético em protozoários e preliminar ensaios biofísicos foram o foco do trabalho. Os modelos estruturais gerados por I-TASSER, Robbeta, AlphaFold2 e homologia compartilharam grande similaridade principalmente no provável sítio ativo da proteína, e a comparação dos modelos indicou AlphaFold2 como o método com melhor predição. Consultas comparativas de estruturas proteicas evidenciaram a qualidade da predição. As análises filogenéticas traçaram um histórico evolutivo para a proteína e apontaram em nível molecular divisões que são biologicamente válidas. Os experimentos de expressão e purificação da proteína apresentaram dificuldade em manter a sua estabilidade. Por fim, a identificação de TcORC1/CDC6 pelo anticorpo anti-ORC1 apontou incorretamente a Proteína de Ligação à Maltose (MBP), e isso culminou na caracterização biofísica ter sido realizada com uma molécula diferente da de interesse. Os resultados abrem caminho para uma futura caracterização biofísica e estrutural de TcORC1/CDC6 e para o melhor entendimento da via de replicação no parasita.

The replication of genetic material is essential for the maintenance and propagation of life. In the case of DNA in eukaryotes, this process begins with Pre-Replication Complex (pre-RC). For its formation, there is regonition of (Origins of Replication (ORIs) in the genome by ORC_1-6, followed by binding to the licensing factors CDC6 and CT1 and recruitment of the MCM_2-7 helicase. The parasite responsible for Chagas Disease Trypanosma cruzi has only ORC1 of the ORI recognition hexamer and this protein is closely related in sequence to CDC6. The prediction of the struture of TcORC1/CDC6 by differents computational methods, its phylogenetic study in Protozoa and preliminary biophysical assays were the focus of this work. The structural models generated by I-TASSER, Robbeta, AlphaFold2 and homology shared great similarity mainly in the probable active site of the protein, and the comparison of the models indicated AlphaFold2 as the method with the best prediction. Comparative queries of protein structures showed the quality of the prediction. Phylogenetic analyses traced an evolutionary history for the protein and pointed out divisions at the molecular level that are biologically valid. The protein expression and purification experiments showed difficulty in maintaining the stability of the protein. Finally, the identification of TcORC1/CDC6 by the anti-ORC1 antibody incorrectly identified Maltose Binding Protein (MPB), and this culminated in the biophysical characterization being performed with a different molecule than the one of interest. The results pave the way for a future biophysical and structural characterization of TcORC1/CDC6 and for a better understanding of the replication pathway in the parasite.