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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.76.2014.tde-29052014-102659
Document
Author
Full name
Luis Guilherme Mansor Basso
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Carlos, 2014
Supervisor
Committee
Costa Filho, Antônio José da (President)
Almeida, Fabio Ceneviva Lacerda de
Azevêdo, Eduardo Ribeiro de
Cilli, Eduardo Maffud
Riske, Karin do Amaral
Title in Portuguese
Interações com membranas de peptídeos de fusão da glicoproteína S do SARS-CoV
Keywords in Portuguese
DEER
Membranas
Peptídeos de fusão
Ressonância Magnética Eletrônica
Abstract in Portuguese
O presente trabalho tem como objetivo geral a consolidação dos esforços iniciados anteriormente em nosso grupo para a utilização de marcação de spin sítio dirigida aliada à técnica de ressonância magnética eletrônica pulsada, em particular, ressonância dupla elétron-elétron (DEER), para medidas de distâncias entre sondas inseridas em moléculas biológicas. Como objetivo específico, interessa-nos a obtenção de informações estruturais de dois peptídeos pertencentes ao domínio de fusão da glicoproteína Spike do coronavírus causador da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS) quando de sua ligação em modelos de membranas biológicas. Valemos-nos de uma abordagem conjunta envolvendo técnicas espectroscópicas, calorimétricas e computacionais para monitorarmos mudanças conformacionais nos peptídeos, suas conformações mais representativas e seus efeitos sobre a estrutura das membranas modelo. Os experimentos de calorimetria mostraram que os peptídeos perturbam fortemente o comportamento termotrópico de vesículas constituídas por fosfolipídios zwiteriônicos e negativamente carregados, sendo o efeito mais significativo na presença de lipídios negativos. Não somente a carga, mas também a estrutura da cabeça polar dos lipídios parece ter contribuição importante para a energética da interação. Os experimentos de dicroísmo circular mostraram que os peptídeos possuem alta flexibilidade conformacional, adotando diferentes estruturas secundárias em ambientes diversos. Uma mistura de conformações do SARSFP coexiste em solução aquosa e nos modelos de membranas, sugerindo alta plasticidade estrutural. Este peptídeo possui, ainda, alta capacidade de auto-associação e forma estruturas β e/ou agregados β regulares. Já o peptídeo SARSIFP adquire estrutura predominantemente α-helicoidal em micelas, estruturas β em lipossomos e conformações irregulares em água. Em particular, este peptídeo parece se ligar às membranas na forma de α-hélices, mas adquirir estruturas β em alta concentração. A flexibilidade conformacional dos peptídeos também foi estudada por dinâmica molecular (DM). Hélices, estruturas β, voltas, dobras e estruturas irregulares são visitadas durante as trajetórias dos dois peptídeos, mas o SARSIFP apresenta menor flexibilidade estrutural. O perfil de energia livre apresentado consiste de uma superfície plana, larga e rasa, sem grandes barreiras energéticas separando os diferentes estados conformacionais. A energia térmica à 300 K é suficiente para visitar boa parte do espaço conformacional acessível aos peptídeos ao longo dos parâmetros de ordem escolhidos. Por fim, obtivemos informações estruturais de análogos paramagnéticos dos peptídeos duplamente marcados com radicais nitróxidos quando em diferentes solventes e miméticos de membranas, além de estudarmos a oligomerização de derivados unicamente marcados. As distribuições de distâncias recuperadas dos sinais de DEER mostram que o SARSIFP adota primariamente α-hélices na presença dos miméticos, com provável formação de estruturas β na presença de micelas negativas. Para o SARSFP, uma larga distribuição de distâncias foi encontrada em todos os miméticos de membranas, refletindo a coexistência de conformações provavelmente bem compactas. Análogos unicamente marcados dos peptídeos ainda revelaram alta capacidade de formação de oligômeros em SDS-d25. Os resultados obtidos com esse conjunto de técnicas permitiram avanços consideráveis sobre as conformações adotadas pelos peptídeos nas diversas situações, o que pode revelar informações importantes acerca dos passos iniciais do mecanismo de fusão com membranas da glicoproteína Spike do coronavírus causador da SARS.
Title in English
Interaction of fusion peptides from SARS-CoV S glycoprotein with membranes
Keywords in English
DEER
Electron Spin Resonance
Fusion peptides
Membranes
Abstract in English
This thesis has the general goal of consolidating in our group the use of site directed spin labeling along with pulsed electron spin resonance, in particular double electron-electron resonance (DEER), for distance measurements in biological molecules. Our specific goal is to obtain structural information on two peptides belonging to the fusion domain of the spike glycoprotein from the SARS coronavirus when in the presence of membrane model systems. We used a joint approach involving spectroscopic, calorimetric, and computational techniques to monitor conformational changes in the peptides, their most representative conformations and their effects on the structure of model membranes. Calorimetric results showed that the peptides strongly perturb the thermotropic behavior of zwitterionic and negatively-charged lipid vesicles, with the largest effects seen with the later. Not only the charge, but also the lipid headgroup structure seems to be relevant for the energetics of the interaction. Circular dichroism experiments showed that the peptides present high conformational flexibility, assuming different secondary structures in diverse environments. A mixture of conformation of SARSFP coexists in aqueous solutions and in the membrane models, suggesting large structural plasticity. This peptide also showed high auto-association tendency forming β structures and/or regular β aggregates. On the other hand, the SARSIFP peptide is predominantly an α-helix when in micelles, β structures in lipossomes, and assumes irregular conformations in water. In particular, this peptide seems to bind to membranes as an α-helix, transitioning to β structures in high concentrations. The conformational flexibility of the peptides was also studied by molecular dynamics (MD). Helices, β structures, turns, hairpins and irregular structures are visited during the trajectories of both peptides, but SARSIFP presents less structural flexibility. The free energy profile is consistent with that of a plane, broad and shallow surface, without large energetic barriers separating the different conformational states. The thermal energy at 300 K is sufficient to make the peptides visit most of the conformational space accessible for a certain choice of order parameters. Lastly, we obtained structural information from paramagnetic analogs of the peptides, which were doubly-labeled with nitroxide radicals, in different solvents and membrane mimetics. We also studied the oligomerization process of singly-labeled analogs. The distance distributions determined from the DEER traces showed that SARSIFP adopts a primarily α-helix conformation in the presence of the mimetics, with the formation of β structures in the presence of negative micelles. DEER results for SARSFP showed a broad distribution of distances in all membrane mimetics, thus reflecting the coexistence of compact conformations. Singly-labeled analogs revealed the high tendency of formation of oligomers in SDS-d25. Our results allowed us to make considerable progress in understanding the conformations of the peptides in the conditions under investigation, which contributed with relevant information on the early steps of the membrane fusion mechanism carried out by the spike glycoprotein from the SARS coronavirus.
 
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Publishing Date
2014-06-03
 
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